Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Regional differences of molecular factors during demyelination and early remyelination in the CNS

Gudi, Viktoria

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory demyelinating disease of the central nervous system (CNS) affecting more than 2.5 mil people worldwide. Demyelinating lesions in MS occur in different brain areas and are not limited to the white matter tracts. Demyelination in the white and grey matter follows different temporal and qualitative pattern. There are strong evidences that these differences are based on different pathomechanisms of de- and remyelination in the white and grey matter. Animal models like cuprizone toxic induced demyelination are powerful tools to investigate this hypothesis. In the cuprizone model, demyelination is induced by chronic oral administration of the copper chelator cuprizone. Cuprizone is toxic for oligodendrocytes, however the precise mode of action is not known. After termination of the cuprizone diet spontaneous remyelination occurs. The model is well characterized, reliable, predictable, and well reproducible. In the current work we analyzed the de- and remyelination in the cerebral and cerebellar white and grey matter, as well as in the hippocampus in the murine cuprizone model. Thereby we focused on the expression of myelin proteins and glial cell responses during de- and remyelination. In all studied brain regions de- and remyelination followed a different temporal and qualitative pattern suggesting different pathomechanisms. Demyelination was first observed in the corpus callosum, followed by hippocampus and the cerebral cortex. Demyelination in the cerebellum was delayed and reached its maximum first after 12 week of cuprizone feeding. There were regional differences in the demyelination pattern and glial responses between white and grey matter of the cerebrum and cerebellum, suggesting different underlying pathomechanisms. Growth factors are known to play important role in the orchestration of the oligodendrocyte lineage development. Therefore, mRNA expression profiles of thirteen growth factors were performed for both the corpus callosum and the cerebral cortex. The following growth factors were up-regulated during demyelination in both investigated areas: GDNF, NRG 1, CNTF, TGF-ß1, HGF, FGF-2, and IGF-1. However, single growth factors showed differences in the expression pattern. GDNF, NRG 1, CNTF, and EGF were maximal up-regulated at the first week of cuprizone feeding, where myelin loss was not microscopic detectable. mRNA expression of IGF-1, TGF-ß1, HGF, and FGF-2 reached their peaks during the period of strongest demyelination parallel to the intensive OPCs proliferation and the start of their differentiation. During remyelination, IGF-1 and TGF-ß1 mRNA expressions were up-regulated in both areas, whereas CNTF, GDNF, BDNF, HGF, FGF-2 mRNA levels were elevated only in the corpus callosum, suggesting to promote remyelination in this white matter tract. PDGF-A was not enhanced in both regions during de- and remyelination. NGF and NT-3 mRNA expressions were down-regulated during demyelination and restored during remyelination in the corpus callosum. In the cortex NGF, NT-3 and BDNF expression was not altered compared to age-matched controls. These findings further corroborate the hypothesis of different regional pathomechanisms during de- and remyelination in the white and grey matter. We also investigated the effects of minocycline and fumaric acid esters (FAE) on de- and remyelination. Both agents are believed to have cell protective and immunomodulating properties. In our study we could show accelerated remyelination in the white but not in the grey matter in response to the FAE treatment, again suggesting different pathomechanisms of remyelination in white and grey matter. However, no FAE effects were found for demyelination. Minocycline treatment diminished myelin loss in both the corpus callosum and the cortex but showed no effect on remyelination. These new data corroborate the hypothesis that minocycline has beneficial effects on demyelination in vivo. Our findings also demonstrate regional differences in tissue reactivity and microglia activation in response to minocycline exposure. The cuprizone animal model of toxic demyelination is an excellent model to study de- and remyelination mechanisms in grey and white matter of the cerebrum and cerebellum and is a potential platform to study effects of exogenously administered therapeutic agents to promote oligodendrocyte survival and remyelination.

Multiple Sklerose ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), die zu einer Demyelinisierung von Axonen führt. Weltweit sind mehr als 2,5 Millionen Menschen von dieser Erkrankung betroffen. Neuere Untersuchungen zeigen, dass die für MS typischen Demyelinisierungsherde nicht nur in der weißen Substanz auftreten, sondern auch in der grauen Substanz zu finden sind. Der Verlauf der Demyelinisierung in der weißen und grauen Substanz unterscheidet sich und scheint auf regional grundlegend verschiedenen molekularen Mechanismen zu beruhen. Tiermodelle, wie zum Beispiel das Toxin induzierte Cuprizone Demyelinisierungsmodell, bieten eine solide Plattform um diese Mechanismen zu untersuchen. Bei diesem gut charakterisierten Tiermodell wird eine Demyelinisierung des Balkens (Corpus callosum) und anderen Gehirnarealen durch die chronische orale Einnahme des Kupferchelators Cuprizone induziert. Der genaue Wirkungsmechanismus von Cuprizone ist nicht geklärt Cuprizone bewirkt ein Absterben der Myelin bildenden Zellen, den Oligodendrozyten. Nach dem Absetzen des Toxins kommt es zu einer spontanen Remyelinisierung. In der vorliegenden Studie wurde die De- und Remyelinisierung in der weißen und grauen Substanz des Zerebrums and Zerebellums sowie im Hippocampus untersucht. Dabei standen die Expression verschiedener Myelinproteine, die Reaktion verschiedener Gliazellen sowie die Expression von Wachstumsfaktoren im Hauptfokus. Die Demyelinisierung wurde erst im medialen Corpus callosum (nach 4.5 Wochen Cuprizone Fütterung), dann nach und nach in den einzelnen Strukturen des Hippocampus (4-6 Wochen) und schließlich in allen kortikalen Zellschichten beobachtet. Die zerebelläre Demyelinisierung erreichte ihr maximales Ausmaß erst nach 12 Wochen der Cuprizone Diät. Sowohl im Großhirn als auch im Kleinhirn verlief die Demyelinisierung in der weißen Substanz schneller als in der grauen Substanz. Auch die Rekrutierung bzw. Aktivierung der Mikroglia wiesen zeitliche und regionale Unterschiede auf. Diese Beobachtungen führten zu der Annahme, dass regional spezifische molekulare Regulierungsmechanismen existieren. Daraufhin wurde die mRNA Expression von 13 Wachstumsfaktoren im medialen Teil des Balkens und lateralen Kortex analysiert. Folgende Wachstumsfaktoren wurden während der Demyelinisierung in der weißen sowie in der grauen Substanz  vermehrt exprimiert: GDNF, NRG1, CNTF, EGF, TGF-ß1, HGF, FGF-2, LIF und IGF-1. Die zeitlichen Expressionsmuster der einzelnen Faktoren unterschieden sich deutlich voneinander. So wurden NRG1, GDNF, CNTF und EGF in der frühren Phase der Demyelinisierung hoch-reguliert, wo der Myelinverlust noch nicht mikroskopisch in Erscheinung getreten war. Die Faktoren IGF-1, TGF-ß1, FGF-2 und HGF erreichten ihre maximale Expression dagegen in der Phase der maximalen Demyelinisierung. Während der Remyelinisierung wurden die Wachstumsfaktoren in der weißen und grauen Substanz unterschiedlich reguliert. Während im Balken die Expression von CNTF, GDNF, HGF, FGF-2 und BDNF deutlich erhöht war, wurden im Kortex keine Veränderungen der mRNA Expression im Vergleich zu altersgleichen Kontrolltieren festgestellt. Die mRNA Synthese der Neurotrophine NT-3 und NGF war im Kortex konstant, während sie im Corpus callosum während der Demyelinisierung deutlich vermindert war und sich später wieder normalisierte. Die PDGF-A mRNA Expression blieb unverändert in beiden untersuchten Arealen. Die festgestellten Unterschiede in der mRNA Expression der verschiedenen Wachstumsfaktoren im Kortex und Corpus callosum bekräftigen die Hypothese der regionalen Unterschiede in der De- und Remyelinisierung der weißen und grauen Substanz. Die Kenntnisse zur Regulation der Faktoren, die bei der Remyelinisierung eine günstige Rolle spielen könnten, eröffnen die Möglichkeiten zur Entwicklung neuer Therapien. In unseren Studien wurden ebenfalls potentielle protektive und remyelinisierende Therapeutika untersucht. Die Wirkung der Substanzen Fumarsäure (FAE) und Minozyklin wurden im Rahmen der Cuprizone induzierten De- und Remyelinisierung untersucht. Die neuroprotektiven und immunsuppressiven Eigenschaften wurden für beide Substanzen in den mehreren wissenschaftlichen Studien beschrieben. In unserem Tiermodell beobachteten wir für FAE eine Beschleunigung in der collosalen aber nicht in der kortikalen Remyelinisierung, was wiederum auf die regional unterschiedlichen molekularen Mechanismen deutete. Die Minozyklin Behandlung milderte die Demyelinisierung in den beiden Arealen, der weißen und der grauen Substanzen. Diese Daten unterstützen die Vermutung, dass Minozyklin einer Demyelinisierung entgegen wirken kann. Die Hemmung der Mikroglia Aktivierung wurde jedoch nur im Kortex beobachtet, was mit der generellen Beobachtung von regionalen Unterschieden in der weißen und grauen Substanzen im Konsens ist und mit der regional spezifischen Gewebereaktivität zu erklären ist. Minozyklin zeigte allerdings keine positiven Effekte auf die Remyelinisierung. In der vorliegenden Studie wurden regionalen Unterschiede zwischen De- und Remyelinisierung in der weißen und der grauen Substanzen auf den molekularen und zellulären Ebenen gezeigt. Dabei erwies sich das Cuprizone Tiermodell als eine zuverlässige Plattform für die Untersuchungen der De- und Remyelinisierung sowohl im Großhirn als auch im Kleinhirn und Hippocampus. Weiterhin zeigte sich die Cuprizone induzierte Demyelinisierung als ein geeignetes Tiermodel für die Identifizierung und Erforschung neuer therapeutischer Präparate.

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Gudi, Viktoria: Regional differences of molecular factors during demyelination and early remyelination in the CNS. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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