Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Entwicklung von Minimierungsstrategien für Campylobacter in Geflügel durch die Anwendung von Bakteriophagen

Hirsch, Konstantin

In Europe, the most frequent causative agents for food borne bacterial infections leading to intestinal disorders are thermophilic Campylobacter species. Recalling the number of reported Campylobacter infections in 2009 as announced by the Robert-Koch Institute, 60113 cases have been reported. The predominant source of these infections is contaminated food. Especially poultry and poultry derived products are responsible, if not sufficiently heated. In addition, a cross contamination due to low hygiene standards in kitchens acts as a risk of infection. The main causative campylobacter species are found to be C. jejuni and C. coli.  Growing resistance to antibiotics during the last years has led to alternative approaches in defying these potentially zoonotic pathogens. One alternative to antibiotics is the intracellular infection of these bacteria with bacteriophages leading to the death of their host. The present study aims at the application of mixed Campylobacter-phages (cocktails) on field isolates of Campylobacter jejuni. First, different enrichment strategies for bacteriophages were compared and the two most effective methods concerning their incubation characteristics were chosen.The best yield combined with high reproducibility of reference Campylobacter-phages was obtained by enriching them on a gelatinous growth medium or with a NZCYM-Overlay-Agar technique, respectively. Furthermore, the lytic capacity of these referential Campylobacter-phages was assessed employing different temperatures (+4°C up to + 42°C). To define the composition of bacteriophage-cocktails, eleven strains of Campylobacter jejuni field isolates, stored in the institute’s bacterial collection, were incubated with 16 reference-phages and typified. Three out of eleven Campylobacter isolates (1473-06, 1478-06 and 1481-06) occurred to be (almost completely) insensitive towards the investigated types of Campylobacter-phages. Using the phage-types φ3 and φ8 for bacterial typing, the growth of scattered and diminutive bacterial colonies was found in the area of lysis. Two Campylobacter isolates (1473-06 and 1481-06) showed a similar genetic pattern, determined via pulsed field gel electrophoresis (PFGE). The phage-typing of C. jejuni 1480-06 resulted in a semi-opaque lysis via φ1, φ2, φ4 and φ5 -Campylobacter-phages, and a secondary opacity was gained by φ3 and φ8-phages. Campylobacter jejuni 1536-06 was typified as only sensitive to roughly half of all tested reference-phages and revealed a progressive mutation alongside the interaction with φ1, φ2, φ5 φ6, φ7 and φ13 –Campylobacter-phages. Finishing the Campylobacter jejuni-phage typifying, two cocktails were composed. The “large one”, containing non-selectively chosen Campylobacter-phage candidates, and the “small one”, only bearing those Campylobacter-phages, which had shown a broad and intense lytic capacity, were subsequently investigated on the field-isolates of C. jejuni. The “large one“, containing all Campylobacter-reference-phages, revealed a clear increase in its lytic capacity, when compared to a solely used phage, as was done whilst typifying. The “small one”, containing φ1, φ2, φ5 und φ13 -C. reference phages, induced a clear lytic zone, when incubated with C. jejuni 1478-06 and a semi-opaque lytic area with C. jejuni 1473-06. Both strains are judged weakly susceptible concerning the “small cocktail”, as they form opaque plaques, compared to the “large one”. Both cocktails showed no increase in efficacy after a pretreatment of Campylobacter jejuni NCTC 12662 in a micro-aerobic milieu, which was used for enrichment of Campylobacter-phages. Evaluating the efficiency of both cocktails towards the tested field isolates, it can be assumed, that the more different phage types are used, the less effect is likely to be carried out against all type of Campylobacter field isolates. The distinctive feature of Campylobacter-phages to remain vivid and augmentable in a range of temperature from -20°C to +42°C permits both a preventive and a therapeutic application in poultry against Campylobacter. Moreover, the replication of bacteriophages can only take place in presence of bacterial hosts (i.e. Campylobacter). That adverts to a self controlling concentration and a rapid elimination of phage preparations. Therefore, the application of phage preparations in poultry production, especially in broilers, is highly promising.

In Deutschland ebenso wie in Europa allgemein sind thermophile Campylobacter spp. die häufigsten Erreger bakteriell bedingter, lebensmittelassoziierter Durchfall-erkrankungen. Laut den statistischen Angaben des Robert Koch-Instituts lag die Zahl der gemeldeten Campylobacter-Infektionen im Jahr 2009 bei 60113 Fällen. Als Infektionsquelle werden in erster Linie kontaminierte Lebensmittel angesehen. Die bedeutendste Rolle spielen dabei nicht ausreichend erhitztes Geflügelfleisch und -produkte. Auch Lebensmittel, die aufgrund mangelnder Küchenhygiene rekontaminiert wurden, stellen ein Infektionsrisiko dar. Als krankmachende Spezies wurden hauptsächlich Campylobacter jejuni und Campylobacter coli erfasst. In den letzten Jahren hat sich der Trend entwickelt, auf Grund zunehmender Antibiotikaresistenz alternative Wege zur Bekämpfung der zoonotischen Erreger zu finden. Virale Bakterienparasiten oder Bakteriophagen, welche durch eine intrazelluläre Infektion des Bakteriumwirtes zu seinem Absterben führen, werden als Alternative zum Antibiotikaeinsatz angesehen. In der vorliegenden Untersuchung wurden die Campylobacter-Phagen in Cocktailform an Campylobacter jejuni–Feldisolaten getestet. Im Laufe der Vorversuchsphase wurden aus verschiedenen Anreicherungsverfahren von Bakteriophagen zwei Methoden ausgewählt, die sich gemäß Inkubationsbedingungen am besten eigneten. Es erwies sich, dass die höchste Ausgangskonzentration mit einer hohen Reproduzierbarkeit von Campylobacter-Referenz-Bakteriophagen mit der Anreicherungstechnik auf festem Nährmedium bzw. dem NZCYM-Overlay-Agar-Verfahren erreicht wurde. Darüber hinaus wurden Campylobacter-Referenz-Phagen in Hinsicht auf ihre Lyseaktivität bzw. -kapazität unter thermischen Bedingungen von +4°C bis + 42°C charakterisiert. Zu Beginn der Versuchsphase wurden bei der Zusammensetzung von Bakteriophagen-Cocktails elf Campylobacter jejuni-Feldisolate aus der institutseigenen Bakterienbank mittels sechzehn Referenz-Phagen typisiert. Drei aus elf Campylobacter-Isolaten (1473-06; 1478-06 und 1481-06) erschienen fast komplett unempfindlich gegenüber den vorhandenen Campylobacter-Phagentypen. Durch eine Typisierung mit Hilfe der Campylobacter-Phagentypen φ3 und φ8 wurde eine Bildung von feinen, vereinzelten Bakterienkolonien im Lysebereich festgestellt. Zwei Campylobacter-Isolate 1473-06 und 1481-06 verfügten über ein ähnliches, durch PFGE ermitteltes genetisches Muster. Nach der Phagentypisierung des Campylobacter jejuni-1480-06-Stammes wurde neben der semi-opaquen Lyse durch φ1, φ2, φ4 und φ5 -Campylobacter-Phagen noch eine sekundäre Opazität durch φ3 und φ8-Phagentypen ausgelöst. Der Campylobacter jejuni 1536-06 ließ sich lediglich durch die Hälfte der Referenz-Phagen typisieren und ergab eine progressive Mutation während der Interaktion mit φ1, φ2, φ5 φ6, φ7 und φ13 -Campylobacter-Phagentypen. Nach einer Campylobacter jejuni-Phagentypisierung wurden zwei Cocktails zusammengestellt. Der „große“, bestehend aus nicht selektiv ausgesuchten Campylobacter- Phagenkandidaten, und der „kleine“, der nur die Campylobacter-Phagen beinhaltete, welche eine hohe und breite Lysekapazität gezeigt haben, wurden an den Campylobacter-Feldisolaten getestet. Eine Zusammensetzung aller Campylobacter-Referenz-Phagen in einem „großen“ Cocktail ergab einen deutlichen Anstieg der Lysekapazität im Vergleich zum Einsatz eines einzigen Phagen bei der Phagentypisierung. Nach der Applizierung von einem aus φ1, φ2, φ5 und φ13-Campylobacter-Referenz-Phagen bestehenden „kleinen“ Cocktails wurde eine klare Lysezonenbildung mit C. jejuni 1478-06 und eine semi-transparente Lysezone mit C. jejuni 1473-06 erkannt. Beide Campylobacter-Stämme zeigten sich schwach empfindlich durch die opaque Plaquesbildung gegenüber dem „großen“ Campylobacter-Phagen-Cocktail. Es wurde keine Wirkungssteigerung beider Cocktails nach einer mikroaeroben Vorbebrütung mit einem für die Campylobacter-Phagenanreicherung verwendeten Campylobacter jejuni NCTC 12662 festgestellt. Beim Vergleich beider Cocktails bezüglich der Wirksamkeit gegenüber Campylobacter-Feldisolaten wurde ermittelt, dass je mehr Phagentypen ein Phagen-Cocktail enthält, umso geringer eine Wirkung gegen alle Campylobacter-Feldisolate zu erwarten ist. Die Besonderheit der Campylobacter-Phagen bei -20°C bis +42°C vital bzw. vermehrungsfähig zu bleiben, erlaubt sowohl einen präventiven als auch einen therapeutischen Einsatz in Geflügel gegen Campylobacter. Außerdem erfolgt eine Vermehrung von Bakteriophagen nur in der Anwesenheit von bakteriellen Wirten bzw. von Campylobacter, was auf eine Selbstdosierung und eine schnelle Eliminierung von Phagen-Präparaten hindeutet. Dies lässt die Anwendung von Bakteriophagen-Präparaten in der Geflügelproduktion, insbesondere beim Broiler, sehr vielversprechend erscheinen.

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Hirsch, Konstantin: Entwicklung von Minimierungsstrategien für Campylobacter in Geflügel durch die Anwendung von Bakteriophagen. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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