Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Vergleichende Untersuchung der Immunphänotypisierung, Apoptose-Induktion und Bedeutung regulatorischer T-Zellen bei empfänglichen und resistenten Mausstämmen im zentralen Nervensystem während der Theilervirus-Enzephalomyelitis

Klein, Stephanie Kristin

Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) causes a chronic demyelinating leukoencephalomyelitis in susceptible SJL mice, similar to human multiple sclerosis (MS) and leukoencephalitis due to canine distemper virus infection. In comparison, in resistant C57BL/6-mice the virus is eliminated from the brain after an acute polioencephalitis. However, ineffective antiviral immune responses contributes to viral persistence and prolonged inflammation with subsequent myelin loss in SJL mice, representing an important animal model for the chronic-progressive form of MS. Apoptosis of resident neural cells contributes to lesion development, while activation-induced dell death (AICD) of immune cells results in termination of inflammatory responses in several central nervous system disorders. The aim of the present study was to facilitate a detailed phenotypical analysis of inflammatory responses and to detect apoptotic changes in the central nervous system (CNS) of TMEV-infected susceptible SJL-mice and resistant C57BL/6-mice. 60 TMEV- or mock-infected SJL und C57BL/6 mice were necropsied at 7, 14, 56, 98, and 196 days post infection (dpi). Immunhistochemistry (IHC) to detect CD3 (T cells), Foxp3 (regulatory T cells, Treg), CD25 (effector T cells/regulatory T cells), CD45R/B220 (B cells), CD95 (Fas-expressing cells), CD107b (macrophages/microglia) and GFAP (astrocytes) was performed on paraffin-embedded or frozen tissue brain and spinal cord samples. Apoptotic cells were detected by a caspase-3 specific antibody using IHC and TdT-mediated dUTP-biotin nick end labelling (TUNEL). Both mice strains showed T cell-dominated inflammatory responses in the cerebrum at 7 and 14 dpi and in the brain stem and spinal cord of infected SJL-mice starting at the 14 dpi until the end of the study period (196 dpi). Macrophages/microglia were found predominantly in the brain stem and spinal cord of SJL-mice during the late phase (56 – 196 dpi). Additionally a significant upregulation of Treg and B cells in the acute phase (7 and 14 dpi) in the cerebrum of infected SJL-mice was detected, while a constant number of Treg was found in the brain stem and spinal cord. Increased numbers of apoptotic cells were present in hippocampus, thalamus and meningeal infiltrates of C57BL/6-mice at 7 and 14 dpi. While in most cerebral regions of both mice strains no inflammatory infiltrates were detectable after the acute phase, the corpus callosum of infected SJL mice showed a significant upregulation of Fas-expression and infiltrations of T cells, B cells, macrophages/microglia and astrocytes at 56 dpi. Inflammatory infiltrates and reduced numbers of apoptotic cells have been detected in the spinal cord during the chronic infection phase. Apoptosis in early cerebral inflammatory lesions of C57BL/6 mice might be a consequence of AICD. Failure of AICD in the cerebrum during the acute phase of infected SJL-mice and suppression of an adequate antiviral immune response evoked by Treg and B cells in association with apoptotic resistance of inflammatory cells might represent a prerequisite for viral persistence and subsequent immune mediated demyelination, as describe for human MS.

Das Theiler-Enzephalomyelitisvirus („Theiler's murine encephalomyelitis virus“, TMEV) verursacht eine chronische, demyelinisierende Leukoenzephalomyelitis bei empfänglichen SJL-Mäusen und dient als bedeutendes Tiermodell für die humane Multiple Sklerose (MS) und die Leukoenzephalitis bei der Hundestaupe. Während das Virus bei resistenten C57BL/6-Mäusen aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) nach einer akuten Polioenzephalitis eliminiert wird, führt eine ineffektive antivirale Immunantwort bei SJL-Mäusen zur viralen Persistenz und verlängerten Entzündungsreaktion und Entmarkung. Bei verschiedenen entzündlichen ZNS-Erkrankungen bewirkt die Apoptose von residenten Zellen eine Zunahme der pathologischen Veränderungen, wohingegen die Aktivierungs-induzierte Apoptose („activation induced cell death“, AICD) von Leukozyten das Ende der Entzündungsantwort im ZNS hervorruft. Ziel der vorliegenden Studie war daher eine detaillierte phänotypische Analyse der Entzündungsantwort und die Detektion von Apoptosen in verschiedenen Regionen des ZNS bei TMEV-infizierten, empfänglichen SJL- und resistenten C57BL/6-Mäusen. Nach intrazerebraler Injektion von 60 SJL- und C57BL/6-Mäuse mit dem schwachvirulenten BeAn-Virusstamm sowie von 60 Plazebo-infizierten SJL- und C57BL/6-Mäusen erfolgte die Sektion am 7., 14., 56., 98. und 196. Versuchstag. Eine immunhistologische Untersuchung (IHC) zur Ermittlung von CD3 (T-Zellen), Foxp3 (regulatorische T-Zellen, Treg), CD25 (T-Effektorzellen/Treg), CD45R/B220 (B-Zellen), CD95 (Fas-exprimierende Zellen), CD107b (Makrophagen/Mikroglia) und GFAP (Astrozyten) wurde an Paraffin-eingebetteten Schnitten bzw. nativen Gefrierschnitten des Gehirns und Rückenmarks (RM) durchgeführt. Apoptotische Zellen wurden mittels IHC (aktivierte Caspase-3) und der TUNEL („TdT-mediated dUTP-biotin nick end labelling“)-Methode detektiert. Beide Mäusestämme zeigten eine T-zelldominierte Entzündungsantwort im Großhirn (7. und 14. Tag post infectionem [pi]). Außerdem konnte eine prominente Ansammlungen von CD3+ T-Zellen (14. bis 196. Tag pi) und Makrophagen/Mikroglia (56. bis 196. Tag pi) im Stammhirn und RM infizierter SJL-Mäuse detektiert werden. Weiterhin fand sich eine signifikante Aufregulation von Foxp3+-regulatorischen T-Zellen und B-Zellen in der akuten Phase (7. und 14. Tag pi) im Großhirn der infizierten SJL-Mäusen. Im weiteren zeitlichen Verlauf war eine konstante Anzahl von Treg im Stammhirn und RM der infizierten SJL-Mäuse ermittelbar. Erhöhte Mengen apoptotischer Zellen waren hauptsächlich im Hippocampus, Thalamus und in den meningealen Infiltraten von C57BL/6-Mäusen am 7. und 14. Versuchstag nachweisbar. Während in den meisten Regionen des Großhirns beider infizierter Mäusestämme keine weiteren Entzündungszellinfiltrate nachweisbar waren, zeigte sich im Corpus callosum infizierter SJL-Mäuse am 56. Tag pi eine signifikant aufregulierte Fas-Expression, jedoch keine Apoptosen. Außerdem lag hier eine Akkumulation von T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen/Mikroglia und Astrozyten vor. Eine lymphozytäre Infiltration und gliale Reaktionen mit Fas-Expression in Verbindung mit einer verminderten Apoptoserate konnten ebenfalls in der weißen Substanz des Stammhirns und RM von infizierten SJL-Mäusen während der Spätphase beobachtet werden (196. Tag pi). Apoptotische Zelluntergänge in frühen, entzündlichen, zerebralen Läsionen der C57BL/6-Mäuse sind als Folge der AICD zu interpretieren und führen möglicherweise zu der Termination der Entzündungszellen in TMEV-infizierten resistenten Mäusestämmen. Eine reduzierte AICD in SJL-Mäusen und eine potentielle Unterdrückung der antiviralen Entzündungsantwort bedingt durch Treg und B-Zellen stellt eine potentielle Voraussetzung für die virale Persistenz und konsekutive immunpathologische Prozesse mit demyelinisierender Leukoenzephalomyelitis dar.

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Klein, Stephanie Kristin: Vergleichende Untersuchung der Immunphänotypisierung, Apoptose-Induktion und Bedeutung regulatorischer T-Zellen bei empfänglichen und resistenten Mausstämmen im zentralen Nervensystem während der Theilervirus-Enzephalomyelitis. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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