Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung über die Virusausbreitung und -persistenz bei der murinen Theiler-Enzephalomyelitis von experimentell infizierten Mäusen mittels polyklonaler Antikörper und RNS-Sonden

Kummerfeld, Maren

The experimental infection with the Theiler‘s murine encephalomyelitis virus (TMEV), a single-stranded RNA virus which belongs to the cardiovirus genus of the family Picornaviridae causes a demyelinating leukomyelitis in susceptible mice strains. Thus, while the virus is eliminated from the brain in resistant C57BL/6 mice after the initial phase, an inadequate antiviral immune response leads to viral persistence in susceptible SJL/J mice. Subsequent, viral antigen-induced delayed-type hypersensitivity and myelin-specific autoimmunity induce inflammatory demyelination predominantly in the spinal cord of susceptible mouse strains, resembling the chronic progressive form of human multiple sclerosis (MS). Previous studies have raised the question of region-specific viral spread and central nervous system (CNS) lesion development during the initiation and progression of experimental Theiler´s murine encephalomyelitis (TME) in resistant and susceptible mice strains. The intention of the first part of the study was to generate and characterize a specific polyclonal antibody for the detection of TMEV in infected tissues and cell cultures. Therefore, New Zealand white rabbits were immunized with purified TMEV of the BeAn strain. The specificity of the antiserum was confirmed by Western blotting and sequence analysis of the recognized antigen by high resolution mass spectrometry. The presence of TMEV-specific polyclonal antibodies in postimmunization sera was tested on TMEV-infected L-cells (murine lung tumor cell line) using an immunofluorescence assay. Additionally, the rabbit serum enabled virus detection in formalin-fixed and paraffin-embedded TMEV-infected BHK21 cell pellets and brain tissue of TMEV-infected mice by immunohistochemistry. Immune electron microscopy revealed colloid gold-labeled picornavirus-typical paracrystalline arrays and non-aggregated viral particles of TMEV-infected BHK21 cells. Strikingly, apart from labeling of aggregated virus particles arranged in paracrystalline arrays, which are detected easily by conventional electron microscopy, the postimmunization sera also allowed the detection of non-aggregated individual viral particles of infected BHK21 cells. The aim of the second part of study was to identify topographical differences of TMEV spread and demyelination in the CNS of experimentally infected susceptible SJL/J mice and resistant C57BL/6 mice. Viral dissemination within the CNS and extraneural tissues was quantified by immunohistochemistry using the generated TMEV-specific polyclonal antibody. Further, viral RNA was detected by in situ-hybridization and the phenotype of infected cells was identified by confocal laser scanning microscopy. Inflammatory responses and demyelination within the CNS were determined by histology using semiquantitative scoring systems. Furthermore, accumulation of microglia/macrophages was quantified in different CNS regions by CD107b-specific immunohistochemistry. Results show an early infection of ependymal and periventricular cells followed by inflammation and demyelination around the fourth ventricle in susceptible SJL/J mice. Persistence of the virus was observed in the brain stem of SJL/J mice during the chronic disease phase. Here, microglia/macrophages and oligodendrocytes represented the primary targets of the TMEV. While periventricular demyelination was transient, white matter lesions of brain stem and spinal cord progressed. Myelin loss was associated with an accumulation of CD107b+ microglia/macrophages. The results of the first part of the study demonstrate the applicability of the generated polyclonal antibody for investigating TMEV cell tropism and viral spread at a cellular and subcellular level. Using this marker a spatiotemporal analysis of virus dissemination and associated injuries in different CNS regions was performed in the second part of the study. Here, the demonstration of ependymal infection and subjacent spread into the brain parenchyma as well as regional virus clearance despite ongoing demyelination in other CNS compartment allows new insights into TME pathogenesis. This novel aspect of virus CNS interaction will enhance the understanding of region-specific susceptibilities to injury and regenerative capacities of the brain in this infectious MS model.

Die experimentelle Infektion mit dem murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus (TMEV), einem einzelsträngigen RNS-Virus, welches zum Genus Cardiovirus und der Familie Picornaviridae gehört, ruft eine demyelinisierende Leukomyelitis in empfänglichen Mäusestämmen hervor. Nach einer akuten Infektionsphase im Gehirn wird das Virus in resistenten C57BL/6-Mäusen eliminiert, wohingegen eine nicht ausreichende antivirale Immunantwort in empfänglichen SJL/J-Mäusen eine Viruspersistenz bedingt. Weiterhin führt das Virusantigen zu einer Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ und Myelin-spezifischen Autoimmunität, welche eine entzündliche Demyelinisierung vorwiegend im Rückenmark empfänglicher Mäusestämme hervorrufen. Diese Veränderungen entsprechen daher denen der chronisch progressiven Verlaufsform der Multiplen Sklerose (MS) des Menschen. Aufgrund der Ergebnisse vorangegangener Studien stellt sich die Frage nach der Virusausbreitung und der Entstehung der Läsionen im Zentralen Nervensystem (ZNS) zu Beginn und während des chronischen Verlaufes der experimentellen murinen Theiler-Enzephalomyelitis in resistenten und empfänglichen Mäusestämmen. Das Ziel der ersten Studie bestand in der Herstellung und Charakterisierung eines spezifischen polyklonalen Antikörpers zur Erkennung des TMEV in infizierten Geweben und Zellkulturen. Hierfür wurden drei weiße Neuseeländische Kaninchen mit gereinigtem TMEV des BeAn-Stammes immunisiert. Die Spezifität des Antikörpers wurde mittels Western Blot bestimmt und eine Sequenzanalyse des erkannten Antigens mittels Massenspektrometrie durchgeführt. Das Postimmunisierungsserum wurde auf Spezifität des polyklonalen Antikörpers in TMEV-infizierten L-Zellen (Lungenzelltumorlinie der Maus) mittels Immunfluoreszenz getestet. Zusätzlich, wurde an Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten TMEV-infizierten BHK21-Zellpellets und Gehirngewebe TMEV-infizierter Mäuse das Virus immunhistochemisch detektiert. Außerdem konnten mittels Immunelektronenmikroskopie Picornavirus-typische parakristalline Ansammlungen und dissoziierte Viren im Zytoplasma TMEV-infizierter BHK21-Zellen nachgewiesen werden. Das Ziel der zweiten Studie bestand in der Identifizierung von topographischen Unterschieden in der Virusausbreitung und Demyelinisierung im ZNS von infizierten empfänglichen SJL/J- und resistenten C57BL/6-Mäusen. Die Virusverteilung im ZNS und in extraneuralen Geweben wurde immunhistochemisch mit Hilfe des hergestellten polykonalen TMEV-spezifischen Antikörpers quantifiziert. Weiterhin wurde zusätzlich virale RNS mittels in situ-Hybridisierung detektiert und der Phänotyp der infizierten Zellen mittels Immunfluoreszenzdoppelmarkierung in der konfokalen Lasermikroskopie dargestellt. Entzündungszellreaktionen sowie die Demyelinisierung wurden histologisch semiquantitativ ausgewertet. Des Weiteren wurden Makrophagen und Mikroglia mittels CD107b-spezifischer Immunhistologie in unterschiedlichen ZNS-Lokalisationen quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten eine frühe Infektion der ependymalen und periventrikulären Zellen, begleitet von einer Entzündungs- und Entmarkungsreaktion um den vierten Ventrikel in empfänglichen SJL/J-Mäusen. In der chronischen Phase lag eine Viruspersistenz im Stammhirn und Rückenmark infizierter SJL/J-Mäuse vor. Die primären Zielzellen der Persistenz des BeAn-Virus waren Mikroglia/Makrophagen und Oligodendrozyten. Während die periventrikuläre Demyelinisierung um den vierten Ventrikel in der chronischen Phase abnahm, stieg der Schweregrad der Läsionen in der weißen Substanz des Stammhirns an. Der Myelinverlust war von einer Ansammlung von CD107b+-Mikroglia/Makrophagen begleitet. Die Ergebnisse des ersten Teils zeigten die vielfältige Verwendungsmöglichkeit des polyklonalen Antikörpers zur Untersuchung des TMEV-Zelltropismus und der Virusausbreitung auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Mit Hilfe dieses Antikörpers konnte eine Untersuchung der Virusverteilung in verschiedenen Regionen des ZNS an unterschiedlichen Zeitpunkten und der damit verbundenen Entzündungsreaktionen im Rahmen der zweiten Studie erfolgen. Die ependymale Infektion und konsekutive periventrikuläre Entmarkung stellt ein bislang nicht beschriebenes Phänomen bei der TME dar. Die neuen Aspekte bezüglich der Virusausbreitung im ZNS liefern daher einen Beitrag zum besseren Verständnis regionabhängiger Entzündungsreaktionen und regenerativer Vorgänge in diesem viralen MS-Modell.

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Kummerfeld, Maren: Untersuchung über die Virusausbreitung und -persistenz bei der murinen Theiler-Enzephalomyelitis von experimentell infizierten Mäusen mittels polyklonaler Antikörper und RNS-Sonden. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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