Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Regulation of excitatory amino acid transporter 2 (EAAT2) by carboxy-terminal domains

Leinenweber, Ariane

Excitatory amino acid transporter 2 (EAAT2) is a high affinity glutamate transporter predominantly expressed in astroglia. Human EAAT2 encompasses eight transmembrane domains and a carboxy-terminal domain consisting of 74 amino acids that resides in the cytoplasm. Recent data suggested that oxidative stress activates caspase-3, resulting in a carboxy-terminal truncation (S506X EAAT2) [Boston-Howes et al., 2006]. The role of this region was examined by studying various carboxy-terminal truncations and mutations via heterologous expression in mammalian cells, whole-cell patch clamp recording, radiotracer flux measurements and confocal imaging. S506X exhibits indistinguishable properties of WT EAAT2 and modifies neither uptake nor anion currents. Removal of the complete carboxy-terminus (K498X EAAT2) results in loss of function due to intracellular retention of truncated proteins. However, a short stretch of amino acids (E500X EAAT2) within the carboxy-terminus results in correctly processed transporters. E500X reduces glutamate uptake currents by 90%. Moreover, the voltage and substrate dependence of E500X anion currents is significantly altered. External Na+ modifies EAAT2 anion channels and stimulates anion currents in the presence of L-glutamate, while increased [Na+] reduces such currents without glutamate. In cells internally dialyzed with Na+, WT and E500X display almost comparable Na+-dependencies. With K+ as main internal cation, E500X EAAT2 exhibits a drastically increased apparent dissociation constant for external Na+. Throughout all mammalian glutamate transporters, the carboxy-terminus is encircled by amino- and carboxy-terminal cytoplasmic regions of hairpin 1, including each a pair of basic amino acids. These four residues were mutated in EAAT2 in two double and two single mutations, which result in correctly processed transporters. While double mutation RK(341-342)QE as well as single mutations K383E and R384Q merely reduced uptake currents and glutamate dependent anion currents, the double mutation KR(383-384)EQ additionally exhibits a completely altered Na+-dependence with increasing currents due to increasing [Na+] and a blocking effect of glutamate on both uptake and anion currents. These results demonstrate that both the carboxy-terminus and hairpin 1 modify the glutamate uptake cycle, possibly affecting the movements of the translocation domain of EAAT2 glutamate transporter.

Der exzitatorische Aminosäure-Transporter 2 (Excitatory amino acid transporter 2, EAAT2) ist ein hochaffiner Glutamat-Transporter, der überwiegend in Astrozyten exprimiert ist. Der humane EAAT2 umfasst acht Transmembrandomänen sowie einen 74 Aminosäuren langen zytoplasmatischen Carboxy-Terminus. Eine Studie zeigte kürzlich, dass das Enzym Caspase-3, aktiviert durch oxidativen Stress, den Carboxy-Terminus abschneidet und eine Trunkierung S506X EAAT2 erzeugt [Boston-Howes et al., 2006]. Verschiedene Trunkierungen und Mutationen wurden erstellt und in einer Säugetier-Zelllinie exprimiert, um die Bedeutung dieses acht Aminosäuren langen Carboxy-terminalen Abschnitts mittels Patch-Clamp Technik, radioaktiver Glutamat-Akkumulation und Konfokalmikroskopie zu untersuchen. Die Trunkierung S506X EAAT2 modifiziert weder die durch Glutamataufnahme erzeugten Ströme noch EAAT2-assoziierte Anionenströme und weist unverändert die Eigenschaften des Wildtyps auf. Das Entfernen des kompletten Carboxy-Terminus (K498X EAAT2) führt dazu, dass der Transporter nicht in die Membran integriert wird und somit zum Funktionsverlust. Ein kurzes Stück des Carboxy-Terminus (E500X EAAT2) reicht jedoch für die korrekte Integration des Transporters in die Membran aus. E500X EAAT2 reduziert die Glutamataufnahme um 90%. Weiterhin verändert die Trunkierung signifikant die Spannungs- und Substratabhängigkeit der Anionenströme. In der Gegenwart von Glutamat stimuliert extrazelluläres Na+ EAAT2-assoziierte Anionenströme, während in der Abwesenheit von Glutamat diese Ströme mit zunehmender Na+-Konzentration reduziert werden. Mit Na+ als intrazelluläres Kation zeigen der Wildtyp und E500X eine vergleichbare Na+-Abhängigkeit. Mit intrazellulärem K+ weist E500X EAAT2 eine drastische Zunahme der Dissoziationskonstanten für extrazelluläres Na+ auf. In durchweg allen Säugetier-Glutamat-Transportern ist der Carboxy-Terminus von den Amino- und Carboxy-terminalen zytoplasmatischen Abschnitten einer Haarnadelstruktur Hairpin 1 umgeben, welche jeweils ein basisches Aminosäurepaar enthalten. Diese vier Aminosäurereste wurden in zwei Einzel- und zwei Doppelmutationen verändert. Die mutierten Transporter werden korrekt in die Membran integriert. Sowohl die Doppelmutation RK(341-342)QE als auch die Einzelmutationen K383E and R384Q reduzieren die durch Glutamataufnahme induzierten Ströme sowie die glutamatabhängige Zunahme der Anionenströme. Die Doppelmutation KR(383-384)EQ weist zusätzlich eine vollkommen veränderte Na+-Abhängigkeit auf, die sich in der Abwesenheit von Glutamat mit zunehmender Na+-Konzentration durch eine signifikante Stromzunahme auszeichnet. Glutamat hingegen hat einen hemmenden Effekt sowohl auf Anionenströme als auch auf Ströme unter Glutamataufnahme-Bedingungen. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass sowohl der Carboxy-Terminus als auch Hairpin 1 den Glutamataufnahme-Zyklus modifizieren und möglicherweise an der Bewegung der Translokationsdomäne in EAAT2 beteiligt sind.

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Leinenweber, Ariane: Regulation of excitatory amino acid transporter 2 (EAAT2) by carboxy-terminal domains. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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