Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Die molekulare Pathologie der neurodegenerativen Erkrankung Spinale Muskelatrophie

Nölle, Anna

Proximal Spinal Muscular Atrophy (SMA) is an autosomal recessive disease accompanied by a degeneration of the α-motor neurons in the anterior horn of spinal cord and in brainstem. The degeneration is caused by a deletion or mutation of the Survival of motoneuron 1 (SMN1) gene leading to a reduction in the SMN protein level. The ubiquitously expressed SMN gene is involved in many different functions in the cell. The SMN protein is located in perinuclear complexes as well as in nuclear bodies (cajal bodies and gems) mediating the assembly of the spliceosomal RNA-protein complexes (snRNPs). Additionally to the nuclear function, SMN plays a regulative role in actin dynamics. In different in vitro and in vivo SMA models, defects of the axonal outgrowth and development of the neuromuscular junction has been reported. Our group has demonstrated in PC12 cells that SMN regulates neurite outgrowth via the actin cytoskeleton in presence of the nerve growth factor (NGF). Concomitantly, changes of the actin regulating Rho-kinase (ROCK) pathway have been detected in this cellular system. The present work confirmed a differential regulation of the ROCK pathway by depletion of SMN in a severe SMA mouse model. Biochemical analysis of spinal cord lysats showed a hyperphosphorylation of Profilin2. Profilin2 is phosphorylated by interacting with ROCK2. In the present work the importance of phosphorylation of the serine residue 137 with regard to neurite extension has been demonstrated. SMN exhibits a poly proline domain putatively mediating a direct interaction with Profilin2. In the following studies a direct interaction of SMN with Profilin2 has been detected using a new in vivo protein interaction assay. Furthermore, the importance of the proline residues 219-224 for the Profilin2 interaction has been demonstrated. This finding points to a direct connection between SMN and the ROCK pathway. Additionally, we analyzed mutations of SMA patient’s SMN with regard to neuronal differentiation. In the morphological analysis, overexpression of the mutants resulted in inhibition of the neurite outgrowth comparable to observations under SMN-Knock-Down conditions. The EGFP-tagged mutants showed no differences in the distribution of the SMN complexes indicating that inhibition of the neurite outgrowth is caused by a specific defect. In summary, this work demonstrates a regulative role of SMN in vitro and in vivo regarding the ROCK pathway and actin dynamics. The outcomes of this study and the results of other groups, showing that the ROCK pathway is altered in SMN depleted motor neurons and can be modified by ROCK inhibition, point to the ROCK pathway as a potential target for pharmacological interventions.

Die proximale Spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine autosomal rezessive Erkrankung, die mit einer Degeneration der α-Motoneurone im Vorderhorn des Rückenmarks sowie im Hirnstamm einhergeht. Die Degeneration wird verursacht durch eine Deletion oder Mutation des Survival of motoneuron 1 (SMN1) Gens, die zu einer Reduktion des Proteinspiegels führen. SMN wird ubiquitär exprimiert und nimmt in der Zelle viele verschiedene Funktionen wahr. Das SMN-Protein lokalisiert perinukleär sowie in den Kernkörperchen (Cajal-Körperchen und Gems) und vermittelt die Assemblierung von spleißosomalen RNA-Proteinkomplexen (snRNPs). Neben dieser nukleären Funktion nimmt SMN eine wichtige Rolle bei der Regulation des Zytoskeletts ein. Dies belegen Untersuchungen an verschiedenen In-vitro- und In-vivo-Modellen der SMA, die Störungen beim axonalen Wachstum und bei der Ausbildung der neuromuskulären Synapse (Neuromuscular junction, NMJ) aufweisen. Unsere Arbeitsgruppe hat die Auswirkung von SMN auf das axonale Wachstum bei differenzierten PC12-Zellen untersucht und festgestellt, dass SMN das Neuritenwachstum über das Aktin-Zytoskelett in Anwesenheit von dem Nervenwachstumsfaktors NGF beeinflusst (van Bergeijk et al., 2007). Gleichzeitig konnten in SMN-defizienten PC12-Zellen Veränderungen eines Aktin-regulierenden Signalwegs, des ROCK-Wegs, nachgewiesen werden. In dieser Arbeit konnte belegt werden, dass der ROCK-Weg bei einem SMN-Mangel auch in vivo differenziell reguliert wird. Dies zeigten die biochemischen Analysen von Rückenmarkslysaten eines SMA-Typ-I-Mausmodells, bei denen eine Hyperphosphorylierung von Profilin2 beobachtet werden konnte. Profilin2 wird über eine Interaktion mit ROCK2 phosphoryliert In PC12-Zellen konnte gezeigt werden, das die Phosphorylierung am Serinrest 137 die Neuritenlänge beeinflusst. SMN besitzt eine Poly-Prolin-Domäne, die eine direkte Interaktion mit Profilin2 vermuten ließ. Es konnte gezeigt werden. dass die Prolinreste 219-224 für die Interaktion von Bedeutung ist. In nachfolgenden Untersuchungen konnte über einen neuen Protein-Protein-Interaktionsassay in vivo in einem zellulären System eine direkte Bindung von SMN an Profilin2 nachgewiesen werden. Dieser Befund legt die Annahme einer direkten molekularen Verbindung von SMN mit dem ROCK-Weg nahe. Um einen Zusammenhang mit der SMA-Pathogenese herzustellen, wurden die in Patienten gefundenen Punktmutationen W92S, E134K, S230L, Y272C, T274I näher untersucht. Interessanterweise konnte festgestellt werden, dass die Profilin2-Bindung bei der SMN-Mutante S230L gestört ist. In morphologischen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass die Überexpression dieser Mutanten ähnlich wie bei einem Knock-Down von SMN zu einer Hemmung des Neuritenwachstums führt. Mikroskopisch zeigten die Mutanten keine veränderte Verteilung der SMN-Komplexe, was auf einen spezifischen Defekt der Mutationen bei der Regulation des Neuritenwachstums hinweist. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass SMN in vitro und in vivo einen regulatorischen Einfluss auf den ROCK-Weg ausübt. In Verbindung mit aktuell veröffentlichen Arbeiten, die Veränderungen beim ROCK-Weg in SMN-defizienten Motoneuronen und deren Modifikation durch eine ROCK-Inhibition in vivo beschreiben, deuten diese Ergebnisse auf den ROCK-Weg als eine mögliche Zielstruktur für pharmakologische Interventionen bei der SMA hin. 

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Nölle, Anna: Die molekulare Pathologie der neurodegenerativen Erkrankung Spinale Muskelatrophie. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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