Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Identifizierung und Charakterisierung einer postnatalen Oct4 positiven Zellpopulation in der Maus

Schnabel, Sabine

This study focused on the identification of a primitive stem cell pool for regenerative therapy. The embryonic stem cell factor Oct4 served as marker for naïve cells. The use of the transgenic Oct4-EGFP reporter mouse strain OG2 revealed a formerly unknown dermal Oct4+ population in mice. Oct4+ testicular cells were used to establish the essential methods and to prove the reliability of the reporter mice. Initially heart, bone marrow, spleen, and skin of OG2 mice were flow cytometrically examined. Three age classes were analyzed: infantile, pubertal, and adult. From day 6 p.n. on Oct4+EGFP+ cells could be detected in murine skin. These cells showed a round morphology of about 7-10 µm with regular oval nuclei. At the age of 4 weeks, the highest amount of Oct4+EGFP+ cells was counted. FACS-analysis revealed them to be α6-integrin+cxcr4+sca1+. In qRT-PCR-analysis Oct4 was the only iPS-cell-factor (Oct4, KLF4, Sox2, c-myc) with a higher expression in Oct4+EGFP+ cells than in Oct4-EGFP- cells. To test the role of Oct4+EGFP+ in tissue repair and regeneration, a skin injury experiment was performed. Adult OG2 mice were wounded on their back. After 3 and 7 days respectively skin was examined. After 3 days wounded skin contained a significantly higher amount of Oct4+EGFP+ cells in comparison to healthy mice. Accordingly skin close to the wound margin harbored less Oct4+EGFP+ cells than tissue in the periphery. The age and wound related kinetic of dermal Oct4+EGFP+ cells exhibits interesting analogies to hairfollicle stem cells. These bulge region stem cells show similar processes during hair growth and wound healing. The focus of the hind limb ischemia experiment was to test the ability of isolated Oct4+EGFP+ cells to reside in foreign tissue. Oct4+EGFP+ and Oct4--EGFP- cells isolated from OG2-LacZ-mice were transplanted in ischemic muscles of immunocompromised nude mice. Indeed β-Gal+ structures were found in the Oct4+EGFP+ treated tissue after 4 weeks. This increases the possibility that dermal Oct4+EGFP+ cells remain in ischemic muscle. Regenerative medicine is a promising approach for causal treatment of severe diseases. Despite the last years´ efforts, there is no cell population at hand that provides a high differentiation potential and sufficient security for clinical use. Research focuses on opening up a naïve and easily accessible stem cell pool in adults with minimal risk by avoiding genetic manipulation techniques. Potentially the dermal Oct4+ cell population of adult mice could be the basis for such a therapy with autologous stem cells in the future.

Die regenerative Medizin stellt für eine Vielzahl schwerer Erkrankungen eine vielversprechende Perspektive zur kausalen Behandlung derzeit unheilbarer Leiden dar. Trotz aller Forschungsanstrengungen der letzten Jahre ist noch keine Zellpopulation verfügbar, die über ein ausreichendes Entwicklungs- und Differenzierungspotential verfügt und gleichzeitig die erforderliche Sicherheit für eine klinische Anwendung aufweist. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es, im postnatalen Organismus eine primitive Stammzellpopulation für regenerative Therapieverfahren zu identifizieren. Als Marker für den undifferenzierten Zellstatus wurde der embryonale Transkriptionsfaktor Oct4 gewählt. Durch den Einsatz der Oct4-EGFP-transgenen Reportermauslinie OG2 ist es gelungen, eine bislang noch nicht bekannte Oct4+-Zellpopulation in der Haut von Mäusen zu beschreiben. An Hodengewebe, das Oct4+-Zellen beherbergt, wurden zunächst alle erforderlichen Methoden etabliert und der transgene Reporter auf seine Zuverlässigkeit überprüft. In der ersten Versuchsphase wurden Herz, Knochenmark, Milz und Haut der Reportermäuse in drei Altersstufen („infantil“, „pubertär“ und „adult“) einer durchflusszytometrischen Reihenuntersuchung unterzogen. In der Haut wurden in allen Altersgruppen ab dem sechsten Tag post natum 7-10 µm große Oct4+EGFP+-Zellen mit rundlicher Morphologie und gleichmäßigen ovalen Zellkernen detektiert. Dabei wiesen Tiere in der vierten Lebenswoche die höchsten Gehalte durch EGFP-Expression grün fluoreszierender Zellen auf. Diese Zellen stellten sich in der FACS-Analyse α6-Integrin+cxcr4+sca1+ dar. Die Expression von Oct4, KLF4, Sox2 und c-myc wurde in der qRT-PCR vergleichend zu Oct4-EGFP--Zellen ermittelt. Der Transkriptionsfaktor Oct4 war dabei der einzige der vier iPS-Zellfaktoren, der von Oct4+EGFP+-Zellen signifikant stärker exprimiert wurde. Um eine mögliche Beteiligung dieser Zellen bei der Geweberegeneration zu untersuchen, wurde die Rückenhaut adulter OG2-Mäuse verwundet und ihr Gehalt Oct4+EGFP+-Zellen drei bzw. sieben Tage nach dem Insult ermittelt. In verwundeter Haut wurden drei Tage nach der Verletzung signifikant höhere Zahlen Oct4+EGFP+-Zellen detektiert als in unverwundeten Tieren. Dabei wiesen näher am Wundrand gelegene Areale weniger dieser Zellen auf als weiter entfernte Hautbereiche. Die altersabhängige Dynamik der Oct4+EGFP+-Zellen und ihr Verhalten nach Verwundung weisen interessante Parallelen zu Abläufen im Haarfollikel während der Haarentwicklung und Wundheilung auf. Die Zellen der Bulge-Region stellen die Stammzellnische des Haarfollikels dar und beteiligen sich an der Re-Epithelisierung verletzter Epidermis. Das Potential Oct4+EGFP+-Zellen zur Ansiedlung abseits ihrer angestammten Gewebenische wurde im Hinterlaufischämiemodell getestet. Dabei wurden Oct4+EGFP+- und Oct4--EGFP--Zellen aus doppelt transgenen OG2-LacZ-Mäusen in die ischämische Oberschenkelmuskulatur immundefizienter Nacktmäuse transplantiert. Nach vier Wochen wurden in mit Oct4+EGFP+-Zellen behandelten Geweben β-Gal+-Strukturen nachgewiesen, die auf eine dauerhafte Ansiedlung dieser Zellen im geschädigten Muskel hinweisen. Die vorliegende Arbeit diente der Erschließung eines primitiven Stammzellpools in adulten Geweben, der gut zugänglich ist und dessen Verwendung für den Patienten nicht mit einem Risiko tumoröser Erkrankungen oder immunologischer Abstoßungsreaktionen verbunden ist. Der Einsatz von patienteneigenem Material, das keiner genetischen Manipulation unterzogen wurde, würde hierbei einen entscheidenden Fortschritt bedeuten. Möglicherweise stellt die hier erstmals beschriebene Oct4+-Zellpopulation in der Haut erwachsener Mäuse eine Grundlage für einen solchen autologen Gewebeersatz dar.

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Schnabel, Sabine: Identifizierung und Charakterisierung einer postnatalen Oct4 positiven Zellpopulation in der Maus. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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