Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Migration und Funktion autoaggressiver T-Zellen während der Prodromalphase der Experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

Streyl, Kristina

In focus of this work was the early phase of T-cell induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in the Lewis rat, an animal model for multiple sclerosis in humans. We were mainly interested in auto-aggressive T-cells, specific for the brain-antigen MBP (myelin basic protein) and their migratory and functional properties. It is not exactly known which mechanisms and factors enable the encephalitogenic cells to enter the central nervous system (CNS). MBP reactive T-cells are essential for the induction of EAE which is characterized by a highly predictable monophasic clinical course following upon an obligatory preclinical period of three to four days. Previous work has shown that during the preclinical phase the majority of MBP reactive auto-aggressive T-cells migrate in the periphery and undergo essential changes of the gene expression profile. Such changes seem to be influential on the migratory behaviour of these cells and may be necessary for activated T-cells to infiltrate their target locations in the CNS. Other studies have documented the presence of specific Tcell blasts in the CNS already few hours after T-cell transfer, a time at which the blood-brain-barrier (BBB) is still intact. These early infiltrating “pioneers cells” have been accorded a key function in developing EAE, by possibly causing a proinflammatory CNS status and thereby a permeable BBB. Disease would be induced by subsequently infiltrating unspecific immune cells. The aim of this study was to evaluate which processes are responsible for the time delay in T-cell infiltration into the CNS after cell transfer. Investigations here documented are intended to evaluate cellular and structural properties possibly responsible for the duration of the preclinical phase. To this end we studied MBP specific green fluorescent protein (GFP) expressing T-cells (TMBP-GFP) of different activation states in various organs by means of flow cytometry and intravital microscopy. Results showed a time-coordinated migration pattern of activated T-cells on their way to the CNS. Apart from the lung, where morphological investigations showed an accumulation of encephalitogenic cells, their initially low numbers in the peripheral organs increased slowly from the first day on. Subsequently a massive infiltration of TMBP-GFP cells into the CNS could be observed. Preceding this invasion, no substantial gene regulations of activation markers or chemokines could be detected in the CNS milieu by realtime PCR. Functional studies with migratory T-cells, which had already migrated through the periphery in vivo, were subsequently performed. The aim was to clarify if the cellular changes during the migratory phase were sufficient for provoking encephalitogenic potential of the TMBP-GFP cells. When transferred into a naïve animal migratory T-cells were already detectable in substantial numbers in the spinal cord after few hours. By infusing a sufficient number of migratory cells we were able to induce EAE within 24 hours, which is significantly faster than after the transfer of blast cells, requiring approximately 72 hours for the induction of EAE symptoms. Thus, a priming of the CNS parenchyma for several days does not seem to be required for EAE induction, although our studies cannot exclude a short term priming of a few hours. Concluding these results, an infiltration of encephalitogenic T-cells into the CNS is mainly influenced by cell intrinsic factors. The length of the preclinical phase seems to be largely independent of CNS priming but caused by essential cellular changes as well as the specificity of the infiltrating cells. Ovalbumin (OVA) specific Tcells of comparable activation status displayed a similar migration pattern including infiltration into the CNS, however without causing any clinical symptoms.

Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Frühphase der T-Zell vermittelten Experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) der Lewisratte, ein Modell für die Multiple Sklerose des Menschen. Im Mittelpunkt des Projekts standen autoaggressive, das Hirnantigen MBP (Myelinbasisches Protein) erkennende T-Zellen, deren Wanderung und funktionelle Eigenschaften untersucht wurden. Die Mechanismen und Faktoren, die das gezielte Eindringen der enzephalitogenen T-Zellen in das Zentrale Nevervensystem (ZNS) ermöglichen, sind nur unzureichend bekannt. MBP reaktive T-Zellen sind entscheidend an der Auslösung der EAE beteiligt, die durch einen zeitlich strikt vorhersehbaren Verlauf und ein monophasisches Krankheitsbild mit einer Prodromalphase von drei bis vier Tagen gekennzeichnet ist. Vorarbeiten hatten gezeigt, dass das Gros der autoaggressiven MBP spezifischen T-Zellen während der präklinischen Phase in der Peripherie zirkuliert und dort eine grundlegende Veränderung des Genexpressionsprofils erfährt. Erst diese Veränderungen, welche auch die Wanderungseigenschaften der T-Zellen beeinflussen, scheinen sie zu befähigen in ihr Zielgewebe einzudringen. Andererseits gelang es in früheren Studien, bereits wenige Stunden nach Transfer, bei noch intakter Blut-Hirn-Schranke (BHS), spezifische T-Zellblasten im ZNS nachzuweisen. Diesen früh infiltrierenden „Pionierzellen“ wurde eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung der EAE zugesprochen, weil sie ein proinflammatorisches ZNS Milieu und somit eine erhöhte Durchlässigkeit der BHS induzieren könnten. Durch das nachfolgende Eindringen unspezifischer Immunzellen würde schließlich eine Erkrankung ausgelöst. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, welche Prozesse die Zeitverzögerung der Zelleinwanderung in das ZNS nach TZelltransfer steuern. Die hier vorgelegten Untersuchungen sind ein Beitrag zur Abklärung der zellulären und strukturellen Eigenschaften, welche beim Zustandekommen des präklinischen Intervalls ausschlaggebend sind. Dazu wurde das Migrationsmuster von MBP spezifischen Grünfluoreszierendes- Protein (GFP) exprimierenden T-Zellen (TMBP-GFP) untersucht. Mittels Durchflusszytometrie und Intravitalmikroskopie wurden die Zellen in unterschiedlichen Organen und Aktivierungszuständen geprüft. Es zeigte sich eine zeitlich koordinierte Wanderung aktivierter T-Zellen auf ihrem Weg in das ZNS. Mit Ausnahme der Lunge, deren morphologische Untersuchung auf eine Akkumulation der enzephalitogenen Zellen hinwies, blieb ihre Anzahl am ersten Tag in allen untersuchten Organen sehr niedrig, um dann sukzessive anzusteigen. Anschließend wurde eine deutliche Einwanderung der TMBP-GFP Zellen durch die BHS in das ZNS beobachtet. Vor dieser Masseneinwanderung konnten mittels quantitativer PCR keine wesentlichen Expressionsveränderungen von Aktivierungsmarkern und Chemokinen im ZNS-Milieu nachgewiesen werden. Anschließend folgten funktionelle Studien mit migratorischen T-Zellen, welche in vivo einen nahezu vollständigen Wanderungszyklus absolviert hatten. Diese sollten klären, ob die mit der Wanderung einhergehenden zellulären Veränderungen für das enzephalitogene Potential der TMBP-GFP Zellen ausreichend sind. In ein naives Tier verbracht, waren die migratorischen T-Zellen bereits nach wenigen Stunden in dessen Rückenmark nachweisbar. Wurden sie in ausreichender Anzahl infundiert, waren sie zudem deutlich schneller, nämlich innerhalb von 24 Stunden, in der Lage, eine EAE auszulösen. T-Zellblasten benötigen hierzu ca. 72 Stunden. Ein mehrtägiges Priming des ZNS Parenchyms scheint also nicht notwendig zu sein, wenn auch nicht ausgeschlossen werden kann, dass dies innerhalb weniger Stunden stattfindet. Das Eindringen der enzephalitogenen T-Zellen in ihr Zielorgan ist demnach vornehmlich durch zellintrinsische Faktoren gesteuert. Die Länge der präklinischen EAE Phase scheint, weitestgehend unabhängig von einem Priming des ZNS-Milieus, durch notwendige zelluläre Veränderungen und die Spezifität der T-Zellen bedingt zu sein. Ovalbumin (OVA) spezifische T-Zellen in vergleichbarem Aktivierungszustand wanderten mit ähnlicher Kinetik ins ZNS ein, jedoch ohne klinische Symptome auszulösen.

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Streyl, Kristina: Migration und Funktion autoaggressiver T-Zellen während der Prodromalphase der Experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis. Hannover 2010. Tierärztliche Hochschule.

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