Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Experimentelle Untersuchungen zur epigenetischen Modulation in präpuberalen und adulten bovinen Oozyten

Diederich, Mike

Oocytes derived form prepuberal cattle develop to the blastocyst stage at a significantly reduced rate compared to oocytes from adult cattle. The aim of this thesis was to gain new insights into the developmental competence of prepuberal and adult bovine oocytes. To achieve this, we investigated the mRNA expression profiles of developmentally important non-imprinted genes (GDF9, SLC1A2, PRDX1 and ZAR1) as well as their gene specific methylation status. The gene expression profiles were analyzed by Real Time PCR. For the gene specific methylation analysis the “Limiting Dilution” method was employed. Additionally, we investigated the methylation level of two satellite sequences (repeat sequences), in order to gain insight into the global methylation pattern. The bovine oocytes for these assays were retrieved from four prepuberal and two adult animal groups. The oocytes were classified regarding their morphological properties into class 1-2 (good developmental potential) and class 3 (limited developmental potential). Immature and in vitro matured oocytes of the different groups were used. Three groups of prepuberal animals were administered FSH 48h prior to each OPU session. Additionally, two of the FSH treated groups also received intraovarian injections of IGF-1 and IGF K (0.01 M acetic acid/ injection control), respectively. A subgroup of adult animals also received hormonal follicle stimulation 48h before puncture. For this thesis, we used prepuberal calves with an age of 6 months. These calves were subjected to OPU twice weekly over a period of three weeks. Puncture was repeated every three weeks until the animals were 9 months old. As control, adult cows with at least two lactations were used, with a mean of three lactations   The following findings resulted from this work:   1.      The total number of punctured follicles per animal was significantly higher in the group “Cow” (38±19) than in the group “Cow FSH” (36±16). No other significant differences were observed between the remaining groups. 2.      Animals from the group “Cow” (8±2) and group “Calf FSH+IGF K” (8±2) showed a significantly higher number of follicles per animal and OPU session compared to the groups “Calf” (5±2) and “Calf FSH” (6±2).   3.      A significantly higher number of oocytes was observed between the groups “Calf FSH+IGF K” (26) and “Calf FSH” (15) as well as between “Calf FSH+IGF K” (26) and “Cow FSH” (19).   4.      For the transcripts of the genes GDF9, SLC1A2, PRDX1 and ZAR1 no differences could be shown between the respective groups for immature and matured oocytes. However, within the same group, a significant reduction in mRNA levels was observed for GDF9 and ZAR1 for all groups. For SLC2A1 a significant reduction, with the exception of the intramuscular and intraovarian stimulated calves, could be shown for the groups “Cow”, “Calf”, “Cow FSH” and “Calf FSH”. The transcript for PRDX1 was significantly reduced in the groups “Cow”, “Calf”, “Cow FSH”, “Calf FSH”, “Calf FSH+IGF 1”.   5.      The methylation pattern for the Bovine testis satellite I sequence was examined in immature and matured oocytes of the morphological classes 1-3. For immature oocytes of the quality 1-3 significant differences were found between the groups “Calf” (75.6%), “Calf FSH+IGF-1” (56.1%) and “Cow” (53.8%). After morphological differentiation significant differences were observed between the groups “Cow” (49.6%) and “Calf” (74.6%) as well as for the groups “Cow” (49.6%) and “Cow FSH” (69.8%) for immature oocytes of the quality 1-2. For matured oocytes of high quality (class1-2) a significant difference was shown between “Calf FSH+IGF-1” (71.7%) and “Calf” (53.3%). For immature oocytes of reduced quality (class 3) a significantly enhanced methylation was observed for the group “Calf” (77%) when compared to “Cow” (56.6%) and “Calf FSH+IGF-1” (52.9%). Oocytes from the group “Calf FSH” (68.2%) showed a significantly higher methylation compared to “Calf FSH+IGF-1”, although a reduced methylation level compared to “Calf FSH+IGF K” (81.9%). When the methylation levels before and after in vitro maturation of oocytes class 1-2 within each group are compared, oocytes of the groups “Cow” (49.6% vs. 64.9 %) and “Calf FSH+IGF-1” (60.6% vs. 71.7%) showed a significantly higher methylation level, the group “Calf” (74.6% vs. 53.3%) a significantly lower methylation level after maturation.   6.      For the methylation status of the Bos Taurus α-Satellite I sequence were no significant differences were found between the individual groups and morphological qualities.For the groups “Cow FSH” and “Calf FSH” a significant reduction of methylation was observed for oocytes with good developmental potential after maturation (76.5 vs. 52.5% and 72.8 vs. 57.8%).   7.      A gene specific hypomethylation was shown for the developmentally important non- imprinted genes SLC2A1, PRDX1 and ZAR1 in immature and matured oocytes of all groups. For GDF9 no information regarding methylation could be gathered due to the lack of CpGs.   In conclusion, this is to our knowledge the first report on gene specific methylation of developmentally important non-imprinted genes in immature and in vitro matured bovine oocytes from prepuberal and adult animals. For these experiments age and hormonal status of the animals were taken into consideration. In this project the methylation patterns of two repeated sequences of oocytes from different treatments and age groups and developmental status were determined. The results from the analysis of the repeat sequencing for the different groups have the potential to be used as a point of reference in advanced studies. The results from this investigation give first cognitions regarding gene specific methylation processes in immature and matured oocytes from prepuberal and adult cattle that need to be validated in further studies.

Oozyten von präpuberalen Rindern weisen eine deutlich geringere Blastozystenrate im Vergleich zu adulten Rindern auf. Ziel dieser Arbeit war es, weitere Erkenntnisse zur Entwicklungskompetenz präpuberaler und adulter boviner Oozyten durch Untersuchung der mRNA-Expression von entwicklungsrelevanten nichtgeprägten Genen (GDF9, SLC2A1, PRDX1 und ZAR1) sowie deren genspezifischer Methylierung zu erlangen. Die Analyse der Genexpression erfolgte mittels Real-time PCR. Für die genspezifische Methylierungsanalyse wurde die „Limiting Dilution Methode“ eingesetzt. Zusätzlich wurde der Methylierungsgrad von zwei Satellitensequenzen (Repeatsequenzen) untersucht, um einen Einblick in das globale Methylierungsmuster zu bekommen. Für die Untersuchungen wurden bovine Oozyten aus vier präpuberalen und zwei adulten Tiergruppen gewonnen. Diese wurden nach morphologischer Beurteilung in die Klasse 1-2 (mit gutem Entwicklungspotential), und Klasse 3 (mit eingeschränktem Entwicklungspotential) eingeteilt. Für die einzelnen Untersuchungen wurden ungereifte und in vitro gereifte Oozyten der verschiedenen Untersuchungsgruppen eingesetzt. Drei der vier Kälberversuchsgruppen erhielten 48h vor jeder OPU-Sitzung eine FSH und zwei dieser Untersuchungsgruppen eine zusätzliche intraovarielle Injektion mit IGF-1 oder IGF K (0,01 M Essigsäure) (Injektionskontrolle). Auch ein Teil der Kühe erhielt 48h vor der Punktion eine hormonelle Follikelstimulierung. Für die Arbeit wurden präpuberale Kälber ab dem 6. Lebensmonat zweimal wöchentlich über einen  Zeitraum von drei Wochen punktiert. Die Punktion wurde nach einer dreiwöchigen Pause bis zum Erreichen des 9. Lebensmonats wiederholt. Zur Kontrolle wurden adulte Kühe mit mindestens zwei Laktationen genutzt.   Folgende Ergebnisse konnten erzielt werden:   1.       Die Gesamtzahl der punktierten Follikel je Tier war in der Gruppe „Kuh“ (38±19) signifikant höher als in der Gruppe „Kuh FSH“ (36±16). Weitere signifikante Unterschiede zwischen den übrigen Untersuchungsgruppen konnten nicht beobachtet werden. 2.      Bei Tieren der Gruppe „Kuh“ (8±2) und „Kalb FSH+IGF K“ (8±2) konnte gegenüber Tieren  der Gruppen „Kalb“ (5±2) und „Kalb FSH“ (6±2) eine signifikant höhere Anzahl Follikel je Tier und OPU-Sitzung festgestellt werden. 3.      Eine signifikant höhere Anzahl Oozyten wurde zwischen den Gruppen „Kalb FSH+IGF K“ (26) und „Kalb FSH“ (15) sowie zwischen „Kalb FSH+IGF K“ (26) und „Kuh FSH“ (19) beobachtet. 4.      Für die Gene GDF9, SLC2A1, PRDX1 und ZAR1 konnten in ungereiften und gereiften Oozyten zwischen den einzelnen Untersuchungsgruppen keine signifikanten Unterschiede dargestellt werden. Beim Vergleich innerhalb der Untersuchungsgruppen wurde nach Maturation für die Gene GDF9 und ZAR1 ein signifikanter Rückgang der mRNA-Menge in allen Gruppen beobachtet. Für SLC2A1 wurde, mit Ausnahme der i.m. und i.o stimulierten Kälber, ein signifikanter Rückgang in den Gruppen „Kuh, Kalb, Kuh FSH und Kalb FSH“ festgestellt. Für das Gen PRDX1 wurde in den Gruppen „Kuh, Kalb, Kuh FSH, Kalb FSH und Kalb FSH+IGF 1“ ein signifikanter Rückgang nachgewiesen. 5.      Das Methylierungsmuster für die Bovine testis satellite I Sequenz wurde in ungereiften und gereiften Oozyten der morphologischen Klasse 1-3 bestimmt. Für ungereifte Oozyten der Klassen 1-3 wurden signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen „Kalb“ (75,6%), „Kalb FSH+IGF-1“ (56,1%) und „Kuh“ (53,8%) beobachtet. Nach der morphologischen Differenzierung wurden für ungereifte Oozyten der Klassen 1-2 signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen „Kuh“ (49,6%) und „Kalb“ (74,6%) sowie zwischen „Kuh“ (49,6%) und „Kuh FSH“ (69,8) festgestellt. Für gereifte Oozyten der Klassen 1-2 bestand ein signifikanter Unterschied zwischen der Gruppe „Kalb FSH+IGF-1“ (71,7%) und „Kalb“ (53,3%). Bei ungereiften Oozyten der Klasse 3 wurde eine signifikant höhere Methylierung der Gruppe „Kalb“ (77%) gegenüber „Kuh“ (56,6%) und „Kalb FSH+IGF-1“ (52,9%) ermittelt. Oozyten aus der Gruppe „Kalb FSH“ (68,2%) wiesen eine signifikant höhere Methylierung gegenüber „Kalb FSH+IGF-1“ auf, aber eine niedrigere gegenüber „Kalb FSH+IGF K“ (81,9%). Die Oozyten der Gruppe „FSH+IGF K“ wiesen eine signifikant höhere Methylierung gegenüber „Kalb FSH+IGF-1“ auf. Beim Vergleich der Methylierung nach in vitro Reifung der Klassen 1-2 innerhalb jeder Untersuchungsgruppe wiesen Oozyten der Gruppen „Kuh“ (49,6% vs. 64,9) und „Kalb FSH+IGF-1“ (60,6%vs.71,7%) eine signifikante höhere, die Gruppe „Kalb“ (74,6% vs. 53,3%) eine signifikant niedrigere Methylierung auf. 6.      Für die Methylierung der Bos taurus α-Satellite I Sequenz konnten zwischen den einzelnen Versuchsgruppen und morphologischen Klassen keine signifikanten Unterschiede beobachtet werden. Für die Gruppen „Kuh FSH“ und „Kalb FSH“ wurde nach der Reifung der Oozyten mit guten Entwicklungspotential eine signifikante Abnahme der Methylierung (76,5 vs. 52,5% und 72,8 vs. 57,8%) ermittelt. 7.      Für die entwicklungsrelevanten, nichtgeprägten Gene SLC2A1, PRDX1 und ZAR1 wurde in ungereiften und gereiften Oozyten aller Untersuchungsgruppen eine genspezifische Hypomethylierung beobachtet. Für GDF9 konnte aufgrund fehlender CpGs keine Aussage zur Methylierung getroffen werden.   Zusammenfassend ist festzustellen, dass in der vorliegenden Arbeit erstmals an ungereiften und gereiften bovinen Oozyten aus präpuberalen und adulten Tieren die genspezifische Methylierung von entwicklungsrelevanten, nicht geprägten Genen untersucht wurde. Hierbei wurden Alter und hormonelle Behandlung der Tiere berücksichtigt. Innerhalb des Forschungsprojektes wurde das Methylierungsmuster von zwei Repeatsequenzen zwischen verschiedenen Versuchsgruppen und Entwicklungsstadien der Oozyten bestimmt. Die Resultate der Repeatsequenzierung von einzelnen Untersuchungsgruppen können als Referenzwert für zukünftige Untersuchungen eingesetzt werden.   Die hier gewonnenen Ergebnisse geben erste Hinweise auf das genspezifische Methylierungsgeschehen in ungereiften und gereiften Oozyten bei präpuberalen und adulten Rindern. Dieses sollte durch weitere Studien und Analyseverfahren bestätigt bzw. überprüft werden.

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Diederich, Mike: Experimentelle Untersuchungen zur epigenetischen Modulation in präpuberalen und adulten bovinen Oozyten. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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