Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and their tissue inhibitors (TIMPs) in bovine placental cells in vivo and in vitro

Dilly, Marc

The cumulative thesis presented characterizes the expression and functional significance of matrix metalloproteinases (MMPs) and their tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) in bovine placental cells in vitro and in vivo with special reference to trophoblast giant cell (TGC) invasion/migration and placental retention. The bovine synepitheliochorial placenta is characterized by restricted trophoblast invasion/migration, a unique feature of which the regulatory mechanisms are not completely understood. The activity of MMPs in the extracellular space is specifically inhibited by counteracting TIMPs to serve and control cell migration and tissue remodelling. MMP-9 is present in the bovine placenta throughout gestation; its proteolysis is believed to be predominantly regulated by the action of endogenous TIMP-1. Epidermal growth factor (EGF), as regulator of fundamental cell properties, is expressed in the bovine placenta and capable to up-regulate MMP-9 activity in a variety of cells types. Aim of this in vitro study was therefore to examine the influence of EGF on cell motility, proliferation, as well as MMP-9 and TIMP-1 expression in cultured bovine trophoblast cells. The effect of EGF on MMP-9 and TIMP-1 expression was examined in a trophoblast cell line (F3) by semiquantitative RT-PCR. The proteolytic activity of MMP-9 was determined by zymography. Migration assays were performed using a Boyden chamber and cell motility was measured by time-lapse analyses. To identify the involved signalling cascades, phosphorylation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) 42/44 and Akt was detected by Western blot. EGF treatment increased both the abundance of MMP-9 and TIMP-1 mRNAs and the proteolytic activity of MMP-9. Furthermore, EGF stimulated proliferation and migration of F3 cells. Addition of specific inhibitors of MAPK (PD98059) and/or phosphatidylinositol 3-kinases (LY294002) activation abolished or reduced EGF-induced effects in all experiments. The results of the in vitro study suggest that EGF could also be responsible for stimulating migration and proliferation of bovine trophoblast cells in vivo, and thus may be involved in bovine placental tissue remodelling and postpartum release of fetal membranes by the upregulation MMP-9 and TIMP-1. The retention of fetal membranes is one of the most common reproductive diseases in cattle causing considerable economic loss (e.g. reduced milk yield, poorer fertility). To allow a physiological release of fetal membranes and avoid placental retention, the tight feto-maternal connection established by fetal cotyledonary villi interdigitating with maternal caruncles must be separated. Membrane-type MMPs have been suggested as potential activators controlling extracellular matrix (ECM) degradation and remodelling. In particular, MMP-14 is able to degrade ECM substrates and activate MMP-2 through binding TIMP-2 at the cell surface. We hypothesize that impaired modulation of the ECM by MMPs/TIMPs participates in the aetiology of bovine retained fetal membranes. This involvement was analysed in vivo comparing placentomes from cows at term parturition and timely release of fetal membranes and cows with retained fetal membranes after various treatments for the induction of parturition, and after elective caesarean sections. The expression of MMP-14, MMP-2 and TIMP-2 was examined by real-time-PCR, immunohistochemistry, Western blot and zymography. The relative mRNA expression levels of MMP-14 was similar in all groups, while the expression levels of MMP-2 and TIMP-2 were higher in most animals with induced parturition and retention of fetal membranes compared to animals without placental retention. In cows with placental retention, MMP-14 protein was expressed in cells of the fetal mesenchyme and maternal stroma, whereas in cows with release of fetal membranes MMP-14 was localized in uninucleated trophoblast cells. MMP-2 could be detected in uninucleated trophoblast cells and the fetal mesenchyme, while TIMP-2 was present exclusively in trophoblast giant cells. The enzyme activity was confirmed by zymography. The co-localization of MMP-14, MMP-2 and TIMP-2 in the fetal compartment, especially in trophoblast cells at term, allows the modulation of ECM composition at the feto-maternal interface and therefore could influence the timely release of fetal membranes in cattle. In conclusion, the specific expression of MMPs and TIMPs in bovine trophoblast cells in vitro and in vivo suggests an involvement of the MMP/TIMP system in TGC migration/invasion and in the aetiology of placental retention. The capability of growth factors, in particular EGF, to induce proteolysis by MMPs and changes in the MMP/TIMP system itself can lead to alterations of the ECM composition and therefore support the release of fetal membranes.

Die vorgelegte kumulative Arbeit charakterisiert die Expression und funktionelle Bedeutung von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und ihren Inhibitoren (TIMPs) in bovinen Plazentazellen unter Berücksichtigung der Invasion/Migration von Trophoblastriesenzellen (TGC) und der Nachgeburtsverhaltung des Rindes. Die bovine synepitheliochoriale Plazenta ist durch eine eingeschränkte Trophoblasteninvasion/-migration gekennzeichnet, eine Besonderheit deren regulative Mechanismen nicht vollständig geklärt sind. Die Aktivität von MMPs im extrazellulären Raum wird durch entgegenwirkende TIMPs spezifisch inhibiert, um Zellmigration und Gewebeumbau zu unterstützen und kontrollieren. MMP-9 ist während der gesamten Trächtigkeit in der bovinen Plazenta vorhanden; seine Proteolyse wird vorwiegend durch die Aktivität von endogenem TIMP-1 reguliert. Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), als Regulator grundlegender Zelleigenschaften, wird in der bovinen Plazenta exprimiert und kann die Aktivität von MMP-9 in einer Vielzahl von Zellarten hoch regulieren. Ziel dieser in vitro Studie war es daher, den Einfluss von EGF auf die Zellmotilität, Zellproliferation sowie die Expression von MMP-9 und TIMP-1 in kultivierten bovinen Trophoblastzellen zu untersuchen. Der Effekt von EGF auf die Expression von MMP-9 und TIMP-1 wurde mittels semiquantitativer RT-PCR in einer Trophoblastzelllinie (F3) untersucht. Die proteolytische Aktivität von MMP-9 wurde mittels Zymographie bestimmt. Migrationsuntersuchungen wurden in der Boyden Chamber durchgeführt und die Zellmotilität wurde mit Hilfe von „time-lapse“ Messungen bestimmt. Zur Identifizierung der beteiligten Signalkaskaden, wurde die Phosphorylierung der mitogen-activated protein kinase (MAPK) 42/44 und Akt mittels Western Blot detektiert. EGF führte zu einem Anstieg der mRNA Expression von MMP-9 und TIMP-1 sowie zum Anstieg der proteolytischen Aktivität von MMP-9. Weiterhin stimulierte EGF die Proliferation und Migration von F3 Zellen. Die Zugabe von spezifischen Inhibitoren für die Signalwege MAPK (PD98059) und/oder Phosphoinositid-3-Kinase (LY294002) führte zu einer Reduzierung oder Aufhebung aller durch EGF induzierter Effekte und Aktivierungen in allen Experimenten. Die Ergebnisse der in vitro Studie lassen vermuten, dass EGF auch für die Stimulation der Migration und Proliferation von bovinen Trophoblastenzellen in vivo verantwortlich ist, und somit über die Hochregulation von MMP-9 und TIMP-1 am plazentaren Gewebeumbau und dem Ablösen der Nachgeburt postpartum beteiligt sein könnte. Die Nachgeburtsverhaltung (Retentio secundinarum) ist eine der häufigsten Reproduktionskrankheiten des Rindes, welche bedeutende ökonomische Verluste verursacht (z.B. reduzierte Milchleistung, geringere Fertilität). Um eine physiologische Ablösung der Nachgeburt zu ermöglichen und eine Nachgeburtsverhaltung zu verhindern, muss die enge feto-maternale Verbindung, welche durch die Interdigitation von fetalen kotyledonären Zotten mit maternalen Karunkeln gebildet wird, von einander getrennt werden. Membrane-type MMPs wurden als potentielle Aktivatoren für den Abbau und Umbau der extrazelluläre Matrix (ECM) vorgeschlagen. Insbesondere MMP-14 ist fähig ECM-Substrate abzubauen und MMP-2 mittels Bindung von TIMP-2 an der Zelloberfläche zu aktivieren. Wir nehmen an, dass eine gestörte Modulation der ECM durch MMPs/TIMPs an der Ätiologie der Nachgeburtsverhaltung beim Rind beteiligt ist. Diese Beteiligung wurde in vivo an Plazentomen von Rindern nach fristgerechter Geburt und zeitgerechten Abgang der Nachgeburt, sowie Plazentomen von Rindern nach verschiedenen Geburtseinleitungen und nach Kaiserschnitt mit Nachgeburtsverhaltung analysiert. Die Expression von MMP-14, MMP-2 und TIMP-2 wurde mittels quantitativer real-time PCR, Immunhistochemie, Western Blot und Zymographie untersucht. Die relative MMP-14 mRNA Expression war in allen Gruppen ähnlich, während die Expression von MMP-2 und TIMP-2 in den meisten Tieren mit Geburtseinleitung und Nachgeburtsverhaltung erhöht waren. Bei Rindern mit Nachgeburtsverhaltung wurde MMP-14 Protein in Zellen des fetalen Mesenchyms und maternalen Stromas exprimiert, wohingegen MMP-14 in Rindern bei denen die Nachgeburt fristgerecht abgegangen war, im uninukleären Trophoblasten detektiert wurde. MMP-2 konnte in uninukleären Trophoblastzellen und im fetalen Mesenchym nachgewiesen werden, während TIMP-2 ausschließlich in Trophoblastriesenzellen lokalisiert war. Die Enzymaktivität wurde mittels Zymographie bestätigt. Die Kolokalisation von MMP-14, MMP-2 und TIMP-2 im fetalen Kompartiment, insbesondere den Trophoblastzellen zum Zeitpunkt der Geburt, erlaubt eine Modulierung der ECM Komposition an der feto-maternalen Kontaktfläche und könnte so den fristgerechten Abgang der Nachgeburt beim Rind beeinflussen. Schlussfolgerung: Die spezifische Expression von MMPs und TIMPs in bovinen Trophoblastzellen in vitro und in vivo weist auf eine Beteiligung des MMP/TIMP Systems bei der TGC Migration/-Invasion sowie der Ätiologie der Nachgeburtsverhaltung des Rindes hin. Die Fähigkeit von Wachstumsfaktoren, insbesondere EGF, Proteolysen durch MMPs und Veränderungen im MMP/TIMP System selbst zu induzieren, kann zu Veränderungen der ECM Komposition führen und somit eine Ablösung der Nachgeburt unterstützen.

Quote

Citation style:

Dilly, Marc: Expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and their tissue inhibitors (TIMPs) in bovine placental cells in vivo and in vitro. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export