Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Plättchengebundene Antikörper und Neutrophilen-Plättchen-Interaktionen bei verschiedenen Erkrankungen des Hundes

Dircks, Brigitte

Besides their functions in hemostasis and thrombus formation, platelets also take part in a multitude of physiologic as well as pathophysiologic processes including inflammation, immunology, tumor spreading, and tissue repair. In the first, retrospective part of this study underlying diseases and clinical and clinicopathologic variables of thrombocytopenic dogs with and without platelet-bound antibodies (PBAs) as well as clinicopathologic variables of dogs with suspected primary immune-mediated thrombocytopenia (pIMT) (i.e. without detected associated disease) were characterized. For this purpose, medical records of thrombocytopenic dogs, in which a PBA test was carried out by use of flow cytometry between January 2004 and December 2006, were reviewed. In 37 of the 83 dogs (45%) included into the study, PBAs were detected. Underlying diseases of dogs with positive and negative PBA test results, however, were of great diversity. Thirteen dogs in which no underlying disease was found were suspicious of having pIMT. Platelet counts were significantly lower in dogs with positive PBA test results (16 × 103 cells/μl; 2–119 × 103 cells/μl, [median; minimum–maximum]) than in dogs with negative PBA test results (44 × 103 cells/μl; 3–115 × 103 cells/μl) (P = 0.005). Dogs with pIMT had significantly lower platelet counts (14 × 103 cells/μl; 2–44 × 103 cells/μl), compared with platelet counts of dogs having secondary IMT (sIMT) (31 × 103 cells/μl; 3–119 × 103 cells/μl). Hemorrhage was detected significantly more often in dogs with positive PBA test results (24/37 [65%]) than in dogs with negative PBA test results (18/46 [39%]). The mean platelet volume (MPV) was significantly lower in PBA-positive dogs (12.5 fl; 7.4–20 fl versus 14.8 fl; 7.8–24 fl) (P = 0.01). An increase in MPV (defined as MPV > 14.3 fl) was found significantly more often in dogs negative for PBAs (19/33 [58%]) than in dogs positive for PBAs (7/26 [27%]). None of the dogs suspected of having pIMT had an increase in MPV. Analysis of bone marrow aspirates revealed an increase in megakaryopoietic activity in 14 of 21 (67%) PBA-positive dogs and in 7 of 18 (39%) PBA-negative dogs; these proportions did not differ significantly. An increase in megakaryopoiesis was detected in all 9 dogs with suspected pIMT in which bone marrow analysis was performed. This was significantly higher than the proportion of dogs with sIMT (6/13). The results of the first part of the present study indicate that immune-mediated destruction is a potent pathogenic mechanism for thrombocytopenia in a variety of underlying conditions. Dogs with a positive PBA test result, and additionally severe thrombocytopenia, an MPV value within or below the reference range, and an increased megakaryopoiesis are suspicious for having pIMT. The MPV appears to be a helpful diagnostic tool in the evaluation of dogs with thrombocytopenia, however, its importance with regard to megakaryopoiesis remains unclear. The second part of this study is addressing PNA in dogs. Increased PNA formation has been detected previously in different diseases in human medicine; however, no data exist regarding the presence of PNA in vivo in dogs. Therefore, the objective of the current study was the measurement of PNA in dogs with systemic inflammatory diseases. In order to characterize relevant factors for the aggregate formation, the influence of various platelet- and neutrophil agonists on PNA formation was analysed in vitro. Furthermore, neutrophil shape characteristics (neutrophil size and granularity), as indicator for the activation of these cells, were studied in dogs with systemic inflammatory diseases and after stimulation with different agonists. Twenty dogs with systemic inflammatory response syndrome (SIRS) of which 6 had sepsis and 12 had disseminated intravascular coagulation (DIC) were included into the study. Blood of 10 clinically owned healthy beagle dogs was used as control blood as well as for incubation with different agonists in the following final concentrations and combinations: phorbol myristate acetate (PMA) (5 µmol/L), collagen (COL) (20 µg/mL), adenosine diphosphate (ADP) (20 µmol/L), epinephrine (EPI) (20 µmol/L), COL (20 µg/mL) + ADP (20 µmol/L), EPI (20 µmol/L) + ADP (20 µmol/L), lipopolysaccharide (LPS) (1, 2, 5, and 10 µg/mL), und arachidonic acid (AA) (0.5, 1, and 2 mmol/L). Platelet-neutrophil aggregates were measured flow cytometrically after early separation of platelets from neutrophils by use of a Ficoll density gradient immediately after blood sampling or after incubation with agonists, respectively, in order to minimize artificial PNA formation. PNA were measured based on the detection of CD61 associated with neutrophils. Quantification of PNA was done by the mean fluorescence intensity (MFI) of all neutrophil cells, and the percentage of CD61-positive neutrophils. Mean forward angle (correlating with cell size) and side angle light scatter values (correlating with granularity and complexity) were recorded as parameters for the neutrophil shape. The MFI (5.1 ± 1.6 [median ± standard deviation] versus 3.3 ± 0.1) (P = 0.003) and the percentage of CD61-positive neutrophils (10.5% ± 7.9versus 2.3% ± 0.2) (P = 0.003) were significantly higher in dogs with SIRS compared to healthy control dogs. Furthermore, increased cell size (P < 0.001), and decreased granularity (P = 0.013) of neutrophils were observed in these dogs. When dogs with and without sepsis or DIC were compared, however, no difference was seen with regard to the previously mentioned parameters. A significant increase in PNA formation of variable degree was seen after incubation of blood with all agonists. Most marked increases in MFI (62.4 ± 29.2 versus 4.2 ± 0.5) (P < 0.001), and percentage of CD61-positive neutrophils (89.4% ± 9.8 versus 4.7% ± 0.6) (P < 0.001) were observed after stimulation with PMA in comparison with unstimulated samples. Incubation with a combination of COL and ADP showed no further increase in PNA formation when compared to incubation with COL alone, whereas a combination of ADP and EPI led to a nearly cumulative response. Incubation of blood with LPS and AA at different dosages resulted in a dose-dependent increase in the MFI as well as the percentage of CD61-positive neutrophils. Incubation with all tested agonists except EPI resulted in an increased cell size and decreased granularity of neutrophils with PMA, again, having the most prominent effect. Combinations of ADP and COL or EPI and ADP showed no additive effect on these parameters. Similar to the PNA formation, incubation with both, LPS and AA, resulted in a dose-dependent increase of cell size and decrease of granularity of neutrophils. In conclusion, increased PNA formation and neutrophil shape changes were found in dogs with systemic inflammatory diseases. The fact, that these changes were also detected after incubation with pure platelet agonists, is indicating the role of platelet activation in aggregate formation. Further studies are necessary to predict the significance of PNA and neutrophil shape changes in the pathogenesis of SIRS and sepsis and whether the measurement of these parameters provides a useful diagnostic tool for the detection of pro-inflammatory states in dogs.

Thrombozyten spielen eine zentrale Rolle bei der Hämostase und Thromboseentstehung und sind maßgeblich an einer Vielzahl weiterer physiologischer und pathophysiologischer Prozesse wie Entzündungsreaktionen, Immunabwehr, Wundheilung und Tumormetastasierung beteiligt. Im ersten, retrospektiven Teil dieser Arbeit wurden zugrundeliegende Erkrankungen, sowie klinische und labordiagnostische Merkmale bei thrombozytopenischen Hunden mit und ohne plättchengebundene Antikörper, sowie labordiagnostische Parameter bei Hunden mit vermuteter primärer immunvermittelter Thrombozytopenie (pIMT) (d.h. ohne nachweisbare Ursache) charakterisiert. Dafür wurden die Patientendaten von thrombozytopenischen Hunden, bei denen im Zeitraum von Januar 2004 bis Dezember 2006 ein Test zur Bestimmung von plättchengebundenen Antikörpern mittels Durchflusszytometrie durchgeführt wurde, retrospektiv ausgewertet. Bei 37 der 83 Hunde (45%), die in die Studie aufgenommen wurden, konnten plättchengebundene Antikörper gefunden werden. Eine Vielzahl zugrunde liegender Erkrankungen wurden bei Hunden sowohl mit als auch ohne plättchengebundene Antikörper diagnostiziert. Von einer pIMT wurde bei 13 Hunden, bei denen keine Grunderkrankung gefunden werden konnte, ausgegangen. Die Thrombozytenzahl war signifikant niedriger bei Hunden mit einem positiven Testergebnis für plättchengebundene Antikörper (16 × 103/μl; 2–119 × 103/μl, [Median; Minimum–Maximum]) im Vergleich zu Hunden mit einem negativen Testergebnis (44 × 103/μl; 3–115 × 103/μl) (P = 0,005). Hunde mit einer angenommenen pIMT hatten signifikant niedrigere Thrombozytenzahlen (14 × 103/μl; 2–44 × 103/μl) verglichen mit Hunden mit einer sekundären IMT (sIMT) (31 × 103/μl; 3–119 × 103/μl). Blutungen wurden signifikant häufiger bei Hunden mit plättchengebundenen Antikörpern gesehen (24/37 [65%] versus 18/46 [39%]). Das mittlere Plättchenvolumen (MPV) war signifikant niedriger bei Hunden mit einem positiven Testergebnis für plättchengebundene Antikörper (12.5 fl; 7.4–20 fl versus 14.8 fl; 7.8–24 fl) (P = 0,01). Weiterhin hatten Hunde ohne plättchengebundene Antikörper (19/33 [58%] signifikant häufiger ein erhöhtes MPV (definiert als MPV > 14.3 fl) als Hunde mit plättchengebundenen Antikörpern (7/26 [27%]). Keiner der Hunde mit einer angenommenen pIMT hatte ein erhöhtes MPV. Die Auswertung der Knochenmarksaspirate ergab eine gesteigerte Megakaryopoeseaktivität bei 14 von 21 Hunden (67%) mit plättchengebundenen Antikörpern und bei 7 von 18 Hunden (39%) ohne solche Antikörper. Dieser Unterschied war nicht signifikant. Bei allen 9 Hunden mit einer pIMT, in denen eine Knochenmarksaspiration durchgeführt wurde, konnte eine gesteigerte Megakaryopoeseaktivität festgestellt werden. Dies war ein signifikant höherer Anteil verglichen zu Hunden mit einer sIMT (6/13). Die Ergebnisse des ersten Teils dieser Arbeit zeigen, dass der immunvermittelte Abbau von Thrombozyten ein bedeutender Pathomechanismus für eine Thrombozytopenie bei einer Vielzahl unterschiedlicher Erkrankungen ist. Hunde, bei denen plättchengebundene Antikörper nachgewiesen werden und die zusätzlich eine schwere Thrombozytopenie, ein niedriges bis normales MPV und eine gesteigerte Megakaryopoeseaktivität im Knochenmark haben, sind verdächtig für eine pIMT. Das MPV scheint ein hilfreiches diagnostisches Mittel bei der Aufarbeitung thrombozytopenischer Hunde zu sein, die Bedeutung im Hinblick auf die Megakaryopoeseaktivität ist jedoch unklar. Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit Plättchen-Neutrophilen-Aggregaten (PNA) beim Hund. In der Humanmedizin konnte eine vermehrte Aggregatbildung bei Patienten mit unterschiedlichen Erkrankungen nachgewiesen werden, jedoch gibt es bisher keine In-vivo-Daten zum Vorkommen von PNA bei Hunden. Daher war das Ziel der eigenen Arbeit der Nachweis von PNA bei Hunden mit systemisch-entzündlichen Erkrankungen. Zur Erarbeitung pathophysiologischer Grundlagen sollte der Einfluss verschiedener Plättchen- und Neutrophilenagonisten auf die Bildung von PNA in vitro untersucht werden. Weiterhin sollte eine Untersuchung der Formveränderungen der neutrophilen Granulozyten als Indikator für eine Aktivierung dieser Zellen bei systemisch-entzündlichen Erkrankungen sowie nach Stimulation mit den unterschiedlichen Agonisten erfolgen. Zwanzig Hunde mit systemischen inflammatorischen Response-Syndrom (SIRS), von denen 6 eine Sepsis und 12 eine disseminierte intravasale Gerinnung (DIC) hatten, wurden in die Studie aufgenommen. Das Blut von 10 klinikeigenen, gesunden Beaglehunden diente als Kontrollblut sowie für die Inkubation mit den Agonisten in den folgenden Endonzentrationen und Kombinationen: Phorbol-myristat-azetat (PMA) (5 µmol/L), Kollagen (COL) (20 µg/mL), Adenosindiphosphat (ADP) (20 µmol/L), Epinephrin (EPI) (20 µmol/L), COL (20 µg/mL) + ADP (20 µmol/L), EPI (20 µmol/L) + ADP (20 µmol/L), Lipopolysaccharid (LPS) (1, 2, 5, and 10 µg/mL), und Arachidonsäure (Arachidonic acid, AA) (0.5, 1, and 2 mmol/L). Für den Nachweis der PNA-Bildung wurde ein einfacher und reproduzierbarer Test entwickelt, bei dem durch die Separation der Thrombozyten von den neutrophilen Granulozyten mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation direkt nach der Blutabnahme (bzw. nach der Inkubation mit den Agonisten) eine artifizielle Formation von PNA weitgehend verhindert werden sollte. Die Messung der Aggregatbildung basierte auf dem durchflusszytometrischen Nachweis von CD61 assoziiert mit neutrophilen Granulozyten. Zusätzlich zur Bestimmung des prozentualen Anteils von CD61-positiven neutrophilen Granulozyten erfolgte die Quantifizierung der PNA durch Bestimmung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) der Zellen. Das mittlere Vorwärts- (als Maß für die Zellgröße) sowie Seitwärtsstreulicht (als Maß für die Granularität und Komplexität) wurden als Parameter für die Form der neutrophilen Granulozyten erfasst. Bei Hunden mit SIRS wurde eine signifikant höhere MFI (5,1 ± 1,6 [Mittelwert ± Standardabweichung] versus 3,3 ± 0,1) (P = 0,003) und ein signifikant größerer prozentualer Anteil CD61-positiver neutrophiler Granulozyten (10,5% ± 7,9versus 2,3% ± 0,2) (P = 0,003) im Vergleich zu den gesunden Kontrollhunden beobachten. Weiterhin konnte bei diesen Hunden eine Zunahme der Größe (P < 0,001) und Abnahme der Granularität (P = 0,013) der neutrophilen Granulozyten gemessen werden. Bei dem Vergleich zwischen Hunden mit und ohne Sepsis, oder mit und ohne DIC konnte jedoch kein signifikanter Unterschied im Hinblick auf die zuvor erwähnten Parameter entdeckt werden. Nach Inkubation mit allen getesteten Agonisten wurde eine signifikant vermehrte PNA-Bildung von unterschiedlicher Ausprägung im Vergleich zu den nicht stimulierten Proben beobachtet, wobei nach Inkubation mit PMA die MFI (62,4 ± 29,2 versus 4,2 ± 0,5) (P > 0,001) und der prozentuale Anteil CD61-positiver neutrophiler Granulozyten (89,4% ± 9,8 versus 4,7% ± 0,6) (P > 0,001) am höchsten waren. Während die gleichzeitige Inkubation mit ADP und EPI zu einer annähernd kumulativen Antwort führte, zeigte die gleichzeitige Inkubation mit COL und ADP keine vermehrte PNA-Bildung verglichen mit der alleinigen Inkubation mit COL. Nach Inkubation mit LPS und AA in verschiedenen Konzentrationen konnte eine dosisabhängige Steigerung der MFI wie auch des prozentualen Anteils CD61-positiver neutrophiler Granulozyten gemessen werden. Formveränderungen der neutrophilen Granulozyten, eine vermehrte Größe sowie verminderte Granularität wurden nach Inkubation mit allen Agonisten mit Ausnahme von EPI beobachtet, wobei PMA wiederum der stärkste Agonist war. Kombinationen von ADP und COL sowie EPI und ADP zeigten keine additiven Effekte auf die Größe oder Granularität der neutrophilen Granulozyten. Gleichermaßen zur PNA-Bildung resultierte die Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen von LPS und AA in einer dosisabhängigen Größenzunahme und Granularitätsabnahme der Zellen. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse des zweiten Teils der Arbeit eine vermehrte PNA-Bildung sowie Formveränderungen der neutrophilen Granulozyten bei Hunden mit systemisch-entzündlichen Erkrankungen. Die Tatsache, dass diese Veränderungen auch nach In-vitro-Stimulation mit reinen Plättchenagonisten gesehen wurden, zeigt die Bedeutung der Plättchenaktivierung für die beobachtete Aggregatbildung. Weitere Studien sind notwendig, um die Signifikanz von PNA und Formveränderungen der neutrophilen Granulozyten in der Pathogenese der SIRS und Sepsis einzuschätzen, wie auch um den klinischen Nutzen dieser Parameter als möglichen Frühindikator bei systemisch-entzündlichen Erkrankungen zu beurteilen.

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Dircks, Brigitte: Plättchengebundene Antikörper und Neutrophilen-Plättchen-Interaktionen bei verschiedenen Erkrankungen des Hundes. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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