Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Histologische und elektronenmikroskopische Untersuchungen der Lunge nach Inhalation von Titandioxid-Nanopartikeln bzw. -Feinpartikeln bei der Ratte

Eydner, Maja

Titanium dioxide nano particles are commonly used in biotechnology, pharmaceutics and cosmetics. They are mainly employed in dyes and lacquers, as well as in sunscreens, textiles and photocatalysis. They are taken up via inhalation, absorption through the skin or ingestion. Due to their small size, nano particles are able to deposit in all regions of the respiratory tract including the deep lung. Furthermore, they can penetrate the cell membrane or be translocated between or through cells resulting in a distribution of nano particles to other parts of the body.   A three week nose-only inhalation study (daily exposition for six hours) with titanium dioxide nano particles and fine particles in rats was performed. The recovery time was 3, 28 and 90 days, respectively. Macroscopically the lungs of treated animals showed white foci, so called dust macules. Histology revealed in all treated groups accumulations of particle-laden macrophages as well as minimal inflammatory and hyperplastic changes. However, there were no differences in the effects between nano- and fine particle-treated rats. An obvious pulmonary inflammation, which is usually caused by particle-induced production of reactive oxygen species, was not evident in this study. The detectable bronchiolo-alveolar hyperplasia was presumably induced by mechanic impacts of particles. Electron microscopy showed an accumulation of particle agglomerates in alveolar macrophages which was quantified by calculating the relative deposition index (RDI) and χ2 values. To a lesser extent, particles in type I pneumocytes were present. However, RDI and χ2 values did not approve a preferred deposition in these cells, although a clear trend was visible. The present study was the first investigation using titanium dioxide particles and performing a prospective investigation of the RDI. Until now only one inhalation study existed, where the RDI has been estimated by retrospective evaluation. However, a different exposition and recovery time-scheme was used (1 hour exposition, 1 and 24 hours recovery, respectively) in the latter. Besides particle deposition in macrophages and type I pneumocytes, agglomerates of particles were occasionally evident in bronchiolar epithelium, in the pulmonary interstitium or in capillary endothelium. Additionally, nano particles in an intracapillary located granulocyte have been detected for the first time. Therefore particle distribution throughout the whole body via blood circulation cannot be ruled out. Significant differences in translocation behaviour of nano particles and fine particles could not be demonstrated which could be due to an agglomeration of nano particles resulting in larger secondary particles. Particles were exclusively located intracytoplasmatically and particle deposition in nucleus, mitochondria or other cell organelles was not detected. However, infrequently degenerating cells, most likely macrophages, containing intracytoplasmic particles were evident in alveoli. In other cells no structural changes of cellular organelles were found on the subcellular level. The measured lung volume did not show any particle-induced changes, which contradicts other studies. In these reports the lung weight was measured and revealed a treatment related increase. The quantification of lung compartments, which has been done for the first time after titanium dioxide inhalation in this study, showed minimal changes. However, these findings were only transient because no change could be observed at all three recovery time points. Therefore it can be concluded that nano particle as well as fine particle exposition in the applied dose range does not lead to major changes of lung structure. The increase in alveolar macrophages in both treated groups was also ultrastructurally quantified. Until now this has been done exclusively by cell counting in bronchiolo-alveolar lavage fluid. The amount of intracapillary thrombocytes and lymphocytes showed no particle related alterations. Merely the amount of macrophages and granulocytes was minimally decreased in the 90 days recovery nano particle group. This could indicate that the inflammation in this group declines quickly. In former studies the amount of inflammatory cells has only been estimated hematologically. An electron microscopical evaluation as performed in the present study, with regard to titanium dioxide exposition, has not been described before. Even though the rat, which shows a proinflammatory lung milieu and is therefore more sensitive to particle induced lung damage, has been chosen as test animal, no severe alterations of the lung were evident. Because a few particle-laden cells in lung vasculature were detected a hematogenous translocation of particles in other regions of the body must be considered. The dosages used in this study induced only minimal changes of the lung. Differences in the particle-induced effects or in translocation behaviour were not evident. This is presumably due to an agglomeration of nano particles, resulting in larger secondary particles and therefore a possible loss in toxicologic potential.

TiO2-Nanopartikel finden generell Verwendung in Biotechnologie, Pharmazie, Kosmetikindustrie und werden hauptsächlich in Farben und Lacken,  als Sonnenschutz, in Textilien und bei der Photokatalyse eingesetzt. Sie können inhalativ, perkutan oder oral adsorbiert bzw. aufgenommen werden. Partikel in Nanogröße können in allen Regionen des Respirationstraktes inklusive der tiefen Lunge abgelagert werden. Auf Grund ihrer geringen Größe können sie direkt durch die Zellmembran in die Zelle gelangen oder indirekt zwischen bzw. durch Zellen transloziert werden, was einen Transport an andere Stellen des Körpers ermöglicht.   Es wurde ein dreiwöchiger Inhalationsversuch mit TiO2-Nanopartikeln und -Feinpartikeln an Ratten durchgeführt. Die Tiere wurden täglich jeweils 6 Stunden exponiert. Die postexpositionellen Erholungszeiten (Recovery) lagen bei 3, 28 oder 90 Tagen. Makroskopisch waren bei partikelexponierten Tieren weiße Foci (sogenannte dust macules) sichtbar. Histologisch ließen sich in allen Behandlungsgruppen partikelbeladene Makrophagen sowie minimale entzündliche und hyperplastische Veränderungen nachweisen. Unterschiede zwischen den durch Nano- bzw. Feinpartikel ausgelösten Effekten waren nicht vorhanden. Eine deutliche Entzündung, wie sie durch Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies von partikelbeladenen Zellen induziert werden kann, wurde in diesem Versuch nicht nachgewiesen. Die vorhandenen bronchiolo-alveolären Hyperplasien sind vermutlich durch rein mechanische Einwirkung der inhalierten Partikel ausgelöst worden. Elektronenmikroskopisch waren bei den mit hohen Dosen Nano- und Feinpartikeln behandelten Tieren agglomerierte Partikelablagerungen vor allem in Alveolar­makrophagen vorhanden, was die Quantifizierung mittels relativem Depositionsindex und χ2-Werten bestätigte. In geringerem Ausmaß waren auch TiO2-Partikel in Typ I-Pneumozyten sichtbar. Die entsprechenden relativen Depositionsindizes und χ2-Werte bestätigten die präferierte Ablagerung in diesem Zelltyp allerdings nicht, ein deutlicher Trend war jedoch erkennbar. Dies ist der erste Versuch mit TiO2-Partikeln, bei dem direkt eine Bestimmung des RDI durchgeführt wurde. Bislang gab es lediglich einen Inhalationsversuch mit TiO2, bei dem die Partikeldeposition im Nachhinein mittels dieser Methoden reevaluiert wurde. Bei diesem waren jedoch die Behandlungs- und die Recovery deutlich kürzer, als in diesem Fall (1 Stunde Exposition und 1 bzw. 24 Stunden Recovery). In Einzelfällen waren Partikelagglomerate im Bronchialepithel, im Interstitium der Lunge und in Kapillarendothelzellen vorhanden. Es wurden erstmals auch Nano­partikel in einem intrakapillären Granulozyten beschrieben. Aufgrund dieser Befunde muss von einer möglichen, wenn auch minimalen, systemischen Verteilung der Partikel über den Blutkreislauf ausgegangen werden. Ein signifikanter Unterschied im Translokationsverhalten der zwei unterschiedlichen Partikeltypen konnte nicht nachgewiesen werden. Dies kann durch die Agglomeration der Nanopartikel mit konsekutiver Entstehung deutlich größerer Sekundärpartikel, bedingt sein. Partikel wurden lediglich intrazytoplasmatisch nachgewiesen, nicht jedoch im Nukleus, in Mito­chondrien oder anderen Zellorganellen. Vereinzelt waren partikelbeladene, degenerierte Zellen in den Alveolen sichtbar, bei denen es sich vermutlich um Makro­phagen handelt. In anderen Zellen waren auf subzellulärer Ebene keine strukturellen Alterationen von Zellorganellen erkennbar. Das im Rahmen der stereologischen Auswertung ermittelte Lungenvolumen zeigte keine behandlungsbedingten Veränderungen, was im Widerspruch zu vielen vorherigen Untersuchungen steht. Bei diesen wurden jedoch nicht die Lungenvolumina, sondern die Lungengewichte bestimmt, welche nach Partikel­inhalation erhöht waren. Die Quantifizierung der Zusammensetzung der Lunge, welche bei dieser Arbeit erstmalig nach TiO2-Inhalation durchgeführt wurde, erbrachte minimale Veränderungen, die jedoch bei keinem untersuchten Kompartiment bei Tieren aller drei Recovery-Zeitpunkte nachweisbar waren. Somit ist davon auszugehen, dass sowohl Nano-, als auch Feinpartikel-Expositionen in diesen Dosisbereichen nicht zu schwerwiegenden Veränderungen der Lungenstruktur führen. Das vermehrte Vorkommen von Alveolarmakrophagen wurde ebenfalls quantifiziert und zeigte erwartungsgemäß einen Anstieg des Makrophagenanteils bei den behandelten Gruppen. Dies wurde bislang lediglich durch die Bestimmung der Zell­zahlen in bronchiolo-alveolärer Lavageflüssigkeit quantifiziert. Die Menge an intrakapillären Thrombozyten und Lymphozyten zeigte keine partikel­induzierte Veränderung. Lediglich die Makrophagen- und Granulozytenzahlen wiesen geringfügige Veränderungen innerhalb der Nanopartikel-Gruppen auf, welche auf ein schnelles Abklingen der minimalen Entzündungsprozesse hindeuten könnten. Bisher wurden nach derartigen Versuchen lediglich die Entzündungszellzahlen im Blut der Tiere bestimmt, eine elektronenmikroskopische Auszählung solcher Zellen ist bisher im Zusammenhang mit TiO2-Exposition nicht beschrieben. Obwohl die Ratte, welche ein proinflammatorisches Lungenmilieu aufweist und somit sensitiver für Schädigungen durch Partikel ist, als Versuchstierspezies gewählt wurde, konnten keine schwerwiegenden Schädigungen der Lunge, keine signi­fikanten Unterschiede im Translokationsverhalten und keine subzellulären Alterationen durch die Inhalation von TiO2-Nanopartikeln und -Feinpartikeln fest­gestellt werden. Auf Grund des Nachweises vereinzelter, partikelbeladener Zellen in den Lungenkapillaren, ist jedoch eine hämatogene Translokation von Partikeln in andere Körperregionen möglich. Die in diesem Versuch verwendeten Expositionsdosen induzierten lediglich minimale Veränderungen der Lunge. Unterschiede in den partikelinduzierten Effekten und dem Translokationsverhalten zwischen Nanopartikeln und Feinpartikel-Gruppen waren nicht vorhanden. Dies ist möglicherweise durch die Agglomeration der Nanopartikel bedingt, was die Bildung größerer Sekundärpartikel zur Folge hatte und so zu einer Verminderung des toxikologischen Potenzials geführt haben könnte.

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Eydner, Maja: Histologische und elektronenmikroskopische Untersuchungen der Lunge nach Inhalation von Titandioxid-Nanopartikeln bzw. -Feinpartikeln bei der Ratte. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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