Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Fourier-Transformations- Infrarotspektroskopie (FTIR) zur Untersuchung von Membranphasenübergängen bei der Tiefgefrierung von Hengstspermien

Friedel, Katharina

Cryopreserved stallion sperm displays a high degree of individual variation with respect to survival after thawing. Our understanding of the underlying mechanisms associated with the large individual variation in cryosensitivity of stallion sperm is still limited. Knowledge on cellular properties that correlate with freezability may help to rationally design customized freezing protocols for stallions of different freezability. In this study we have used Fourier transform infrared spectroscopy for in situ determination of membrane phase and hydraulic permeability properties of stallion sperm from so-called ‘good’ and ‘poor’ freezers. The membrane hydraulic permeability (Lp) and the corresponding activation energy for water transport (ELp) at subzero temperatures were determined from membrane phase changes during freezing at various ice nucleation temperatures. The aim of this study was to demonstrate a correlation between the membrane hydraulic permeability parameters (ELp, Lpg) and freezability of individual stallions. A group of ten Hanovarian stallions consisting of five “good” freezers and five “poor” freezers was selected for the studies. First, fresh and frozen semen of the stallions was analyzed by standard sperm characterization methods to determine motility, membrane- integrity, chromatin integrity, and cell morphology. Cell volume under isotonic conditions, Vo, and the osmotic inactive volume, Vb, were analyzed using a CASYÔ particle counter. The CASYÔ data revealed that a sperm ejaculate consists of two cell populations at room temperature with different osmotic properties, which affected determination of Vb.The FTIR studies showed that under dehydrating freezing conditions stallion sperm membranes display a profound phase transition to a highly ordered gel phase, whereas conditions that likely result in intracellular ice formation leave the membrane lipids in a relatively disordered state. With the FTIR method reported in this study we were able to determine membrane hydraulic parameters at subzero temperatures. Two water transport processes, that of membrane-bound water and that of free water, were identified during freezing of sperm. Glycerol was found to decrease the activation energy for water transport during freezing. Interestingly, membrane phase changes are not prevented in the presence of glycerol but occur over a wider range of temperatures. The membrane hydraulic permeability parameters (ELp, Lpg) that were derived from membrane phase behaviour data during freezing were found to be similar among “good” and “poor” freezers.

Trotz intensiver Bemühungen gibt es Hengste, deren Sperma sich nicht erfolgreich kryokonservieren lässt. Die genauen Ursachen hierfür sind nicht bekannt. Mithilfe von erweiterten Kenntnissen  um die Vorgänge an der Zellmembran während des Einfriervorganges wird es möglich sein, die Einfrierprotokolle für Hengstsperma, vor allem für Hengste mit schlechter Gefriertauglichkeit, wissenschaftlich fundiert zu verbessern. In dieser Studie wurde mittels FTIR Messungen das kälteinduzierte Membranphasenverhalten bestimmt, die Spermienmembranparameter für  zehn Hannoveraner Warmbluthengste bekannter Gefriertauglichkeit (n=5 schlechte Gefriertauglichkeit des Spermas, n=5 gute Gefriertauglichkeit des Spermas) wurden hiervon abgeleitet. Das Ziel dieser Studie war es festzustellen, ob ein Zusammenhang zwischen  biophysikalischen Zellmembranparametern (ELp und Lpg) und der Gefriertauglichkeit von Hengstsperma besteht. Die Permeabilität der Zellmembran für Wasser und andere Substanzen sowie die Volumenregulation der Zelle während des Einfriervorganges sind für den Einfriervorgang von großer Bedeutung. Um die Einteilung der Hengste in Gruppen unterschiedlicher Gefriertauglichkeit zu überprüfen, wurden Frisch- und Auftauproben aller Versuchshengste im Bezug auf die Motilität, die Membran und - Chromatinintegrität und die Zellmorphologie untersucht. Zusätzlichfanden von vier Hengsten Volumenmessungen mittels CASYÔ-Partikelzähler unter verschiedenen osmotischen Bedingungen statt, um dasosmotische Verhalten von Hengstspermien zu untersuchen und deren osmotisch inaktives Volumen Vb sowie das isoosmotische Volumen V0 zu ermitteln. Die CASYÔ Messungen bei Raumtemperatur zeigten, dass in Hengstejakulaten zwei Zellpopulationen mit unterschiedlichen osmotischen Eigenschaften vorhanden sind, welche die Bestimmung von Vb beeinflussen. Mittels der vorgestellten FTIR Methode war es möglich, Zellmembranparameter (ELp und Lpg) von Hengstsperma unter 0°C zu bestimmen. Hierbei konnten unterschiedliche Wassertransportprozesse (membrangebundenes und freies Wasser) beobachtet werden. Es stellt sich außerdem heraus, das Glycerol die Aktivierungsenergie für den Wassertransport während des Einfriervorgangs herabsetzt, aber interessanterweise den Membranphasenübergang der Zellmembran nicht verhindern kann. Der Membranphasenübergang der Zellmembran in Anwesenheit von Glycerol fand jedoch in einem weiteren Temperaturbereich als in Abwesenheit von Glycerol statt. Ein Unterschied zwischen den Hengsten mit guter Gefriertauglichkeit und den Hengsten mit schlechter Gefriertauglichkeit war in den bestimmten Zellmembranparametern, dem Membranphasenverhalten und dem osmotischen Verhalten nicht festzustellen.

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Friedel, Katharina: Fourier-Transformations- Infrarotspektroskopie (FTIR) zur Untersuchung von Membranphasenübergängen bei der Tiefgefrierung von Hengstspermien. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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