Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Establishment of a bovine placental trophoblast cell line and a 3-dimensional spheroid culture model: biological effects of epidermal growth factor (EGF)

Häger, Jan-Dirk

In this cumulative thesis the isolation of the bovine placental trophoblast cell line (F3) and the development of 3-dimensional spheroid model for the latter is reported. It is also shown that EGF stimulates proliferation in F3 cells via the Ras-MAPK pathway in trophoblast cells. In this cumulative thesis the isolation of the bovine placental trophoblast cell line (F3) and the development of 3-dimensional spheroid model for the latter is reported. It is also shown that EGF stimulates proliferation in F3 cells via the Ras-MAPK pathway in trophoblast cells. The bovine trophoblast consists of 80% uninucleate trophoblast cells (UTC) and 20% invasive trophoblast giant cells (TGC). TGC are able to fuse with single caruncular epithelial cells and synthesize unique hormones like bovine placental lactogen (bPL). In vivo they do not express cytokeratin (CK) in contrast to UTC which show cytokeratin expression. In addition several growth factor systems (VEGF, PAF, FGF) are expressed in the bovine placenta and have been colocalized in TGC. Despite several previous studies dealing with the culture of primary bovine placental trophoblast cells a permanent bovine placental trophoblast cells has never been established before. This study describes for the first time the isolation and characterization of such a cell line, termed F3. F3 was characterized by: (1) Expression of a y-chromosomal sequence, (2) CK expression, (3) Occurrence of CK negative/bPL positive TGC in early F3 passages, (4) exclusion of Dil-Ac-LDL and (5) different cell morphology than caruncular epithelial cells (BCEC). After characterization the influence of EGF (50ng/ml) on the proliferation of the bovine trophoblast cells was analyzed by MTT-Assay. To elucidate the EGF induced signalling pathways we analyzed Ras (Ras Pull-Down-Assay, western blot) and MAPK42/44 activation (western blot). We found that EGF strongly stimulated the proliferation of the trophoblast cells via the Ras-MAPK pathway while BCEC cells did not show such a reaction. A striking criterion of cell dedifferentiation in bovine trophoblast cells in vitro is the complete loss of the TGC cell population. In detail the dedifferentiation is reflected by the fact that all cells express CK but no bPL. This is in contrast to the placenta where TGC are CK negative but bPL positive. In order to reinduce TGC differentiation of F3 cells different approaches were used, namely the development of a 3-dimensional spheroid model for F3 cells (1) and collagen-I gel culture of F3 cells (2). The F3 trophoblast spheroids were generated by the hanging drop technique in presence of methocoel (20%) and matrigel (1%). The addition of matrigel was shown to be the crucial factor for F3 spheroids formation within 3 of culture. The spheroids were characterized morphologically by light microscopy (LM), transmission microscopy (TEM), scanning electron microscopy (SEM) and immunohistochemistry (ezrin, vimentin, cytokeratin, placental lactogen). The fluorescent dyes Calcein AM and ethidium homodimer-1 (EthD-1) were used to determine the viability of the spheroidal F3 cells by immunofluorescence (IF). Every F3 spheroid was surrounded by ECM which most likely was matrigel itself (LM, SEM). The F3 spheroids contained an outer vital rim of trophoblast cells and an inner spheroidal core of degenerating cells (IF, TEM). The outer F3 cells were polarized and carried microvilli at their apical poles (TEM). As far as the induction of TGC in F3 cells is concerned neither the formation of trophoblast spheroids (1) nor the collagen gel culture (2) have led to TGC differentiation in F3 cells. This failure might have several physiological (e.g lack of growth factors in culture medium) or cell line based reasons. In conclusion, this thesis demonstrates for the first time the establishment of a permanent bovine placental trophoblast cell line. Furthermore we have shown that trophoblast and BCEC cells differ in their biological response to EGF which indicates different roles for EGF in the bovine placenta in vivo. Additionally a 3-dimensional, matrigel-based trophoblast spheroid model was developed which might turn out useful for future studies on the differentiation and invasion of bovine trophoblast cells in vitro.

Die vorgelegte kumulative Arbeit beschreibt die Etablierung einer bovinen plazentaren Trophoblastzelllinie (F3) für die zusätzlich ein 3-dimensionales Kultursystem (Sphäroid) entwickelt wurde. Es wird außerdem gezeigt, dass EGF die Proliferation der Trophoblastzelllinie über eine Aktivierung des Ras-MAPK Signalweges stimuliert. Der bovine Trophoblast besteht aus 80% uninukleären Trophoblastzellen (UTC) und 20% invasiven Trophoblastriesenzellen (TGC). TGC sind in der Lage mit einzelnen Karunkelepithelzellen zu fusionieren und produzieren Hormone wie das bovine plazentare Laktogen (bPL). Zusätzlich zeigen sie, im Gegensatz zu den UTC, nicht die Expression des  epithelialen Markers Zytokeratin (ZK). Einige der Wachstumsfaktor-Systeme, die in der Rinderplazenta vorkommen (VEGF, PAF, FGF), sind in den TGC kolokalisiert. Auch wenn in vielen früheren Studien mit primären bovinen plazentaren Trophoblastzellen gearbeitet wurde so existierte bis heute keine permanente bovine plazentare Trophoblastzelllinie. In dieser Arbeit wird erstmalig die Isolation einer solchen Zelllinie (F3) beschrieben, welche von einem männlichen Fetus stammt. Die Zelllinie wurde anhand folgender Kriterien charakterisiert: (1) Vorhandensein eines Y-Chromosoms, (2) ZK Expression, (3) Vorkommen von ZK negativen aber bPL positiven TGC in frühen Zellpassagen, (4) Nicht-Aufnahme von Dil-Ac-LDL und (5) unterschiedliche Zellmorphologie im Ggensatz zu Karunkelepithelzellen (BCEC) in Kultur. Nachfolgend wurde der Einfluss von EGF (50ng/ml) auf die Proliferation von F3 mittels MTT-Assay untersucht. Weiterhin wurde untersucht ob die Stimulation von F3 Zellen mit EGF zur Ras (Ras Pull-Down-Assay, Western Blot) oder MAPK42/44 (Western Blot) Aktivierung führt. Es konnte gezeigt werden, das EGF seine proliferativen Effekte in der Trophoblastzelllinie über die Aktivierung des Ras-MAPK Signalweges vermittelt. Im Gegensatz dazu zeigten BCEC Zellen keine Aktivierung des Signalweges oder vermehrte Proliferation nach EGF Gabe. Ein Hauptmerkmal der Dedifferenzierung boviner Trophoblastzellen in Kultur ist, dass die komplette Zellpopulation der TGC verloren geht. Der TGC Verlust wird dadurch gekennzeichnet, dass alle Zellen ZK besitzen, jedoch kein bPL. Im Gegensatz dazu exprimieren TGC in der Plazenta bPL, aber kein ZK. Um die Bildung von TGC aus F3 Zellen zu reinduzieren wurden zwei Ansätze verfolgt: (1) die Bildung von 3-dimensionalen F3 Trophoblastsphäroiden und (2) die Kultur von F3 Zellen auf Kollagen-I Gelen. Die F3 Sphäroide wurden unter Zugabe von Methycellulose (20%) und Matrigel (1%) mittels Hanging drop Technik gebildet. Dabei erwies sich die Zugabe von Matrigel als ausschlaggebend für die Entstehung der Sphäroide nach drei Tagen in Kultur. Die F3 Sphäroide wurden morphologisch mittels Lichtmikroskopie (LM), Transmissions- (TEM) und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) sowie Immunhistochemie (Ezrin, Vimentin, CK, bPL) untersucht. Fluoreszierendes Calcein AM und Ethidium homodimer-1 (EthD-1) wurden benutzt, um lebende und tote Zellen in F3 Sphäroiden per Immunfluoreszenzmikroskopie (IF) zu detektieren. Es zeigte sich, dass jedes F3 Sphäroid von extrazellulärer Matrix (ECM) umgeben war, welche wahrscheinlich aus Matrigel bestand (LM, SEM). Die F3 Sphäroide wiesen eine äußere Zellschicht aus lebenden Trophoblastzellen und einen inneren Kern aus sich in Degeneration befindlichen Zellen auf (IF, TEM). Die äußeren, sphäroidalen F3 Trophoblastzellen waren polarisiert und zeigten Mikrovilli an dem apikalen Zellpol (TEM). Was die in der Studie unternommenen Versuche zur Bildung von TGC angeht (Sphäroidkultur, Kollagen-I Gele), war leider kein Erfolg zu verzeichnen. Dieser Ausgang kann mehrere „physiologische“ Gründe (z.B. Fehlen wichtiger Wachstumsfaktoren im Kulturmedium) haben, oder aber auch Ursachen, die in der Zelllinie selbst begründet sind. Schlussfolgernd kann gesagt werden, dass erstmalig eine permanente bovine plazentare Trophoblastzelllinie etabliert wurde. Weiterhin wurde gezeigt, dass bovine Trophoblastzellen und Karunkelepithelzellen (BCEC) unterschiedlich auf eine EGF Stimulation reagieren, was darauf hindeuten könnte, das dem EGF in der Plazenta unterschiedliche Aufgaben in den beiden Zellpopulationen zukommen. Zusätzlich wurde ein 3-dimensionales Trophoblast Kulturmodell (Sphäroid) entwickelt, welches sich in folgenden in vitro Studien zur Differenzierung und Invasion boviner Trophoblastzellen als nützlich erweisen könnte.

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Häger, Jan-Dirk: Establishment of a bovine placental trophoblast cell line and a 3-dimensional spheroid culture model: biological effects of epidermal growth factor (EGF). Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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