Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Metabolische Aktivierung von Proteratogenen zur Erweiterung von In-vitro-Systemen

Hettwer, Michael

To determine the teratogenic potential of proteratogens in vitro, the presence of biotransforming enzymes is required. Since a number of alternative methods like the embryonic stem cell test (EST) do not provide such a metabolic capacity, the objective of this study was to combine an exogenous metabolic activation system (primary hepatocytes and liver S9 fractions) with F9-cells and the EST. Whereas the S9-Mix is routinely used in the Ames-test, results of this work confirmed its cytotoxic impact on mammalian cells. This cytotoxicity of the S9-Mix could be reduced by techniques such as thermic denaturation and solid phase extraction as demonstrated by the high cell-viability observed after the incubation of F9-cells with the S9-Mix. The biotransformation of VPD to its teratogenic metabolite VPA by the S9 fraction was verified by GC-MS. However, due to the low VPA-concentrations obtained no activation of the luciferase-activity in the pRSV-luc reportergen assay occurred. To investigate the metabolic activation of other proteratogens by this approach and to determine the feasibility of a combination of the S9-Mix with other in-vitro-methods like the EST further testing is suggested. CPA was classified by the PM as a weak embryotoxic compound in the EST without metabolic activation. In addition, formation of the embryoid bodies without substance exposure in the hanging-drop culture was performed to investigate if this had any effect on stem cell differentiation. In case it had no effect, conditions would be favorable for the combination of the EST with a metabolic activation system by using transwells. However, in comparison to the results obtained with the validated EST-protocol the ID50-concentration increased significantly when testing CPA in the EST for seven instead of ten days. Thus, CPA was falsely classified as negative in the PM. When testing VPD and VPA for seven days in the EST a similar effect on the inhibition of the stem cell differentiation was observed. According to the PM of the EST both VPD and VPA were classified as weak embryotoxic compounds even though in vivo VPA exhibits a much higher embryotoxic potential than VPD. Nevertheless, when taking into account the ID50, which was significantly lower for VPA than for VPD, the higher teratogenic potential of VPA compared to VPD was detected in vitro with the EST. In order to combine murine primary hepatocytes with the EST, the liver cells were cultured in stem-cell-medium with reduced amounts of ingredients (e.g. FBS, 2-mercatpethanol). Thus, the supernatant of hepatocytes incubated for six hours could be applied to the EST without any detrimental effects on stem cell differentiation. When using liver cell supernatant in the EST for seven days, even a maximum incubation time of twelve hours was feasible. Since contaminations constantly occurred when performing MTT-assays with the hepatocytes´ supernatant, cytotoxic endpoints could not be determined. During a six-hour incubation with murine liver cells, 30 to 60% of CPA was metabolised. Subsequent testing of the supernatant in the EST led to a 70-fold lower ID50 compared to the resulting value of non-metabolised CPA. Based on this strong decrease of the ID50, an increased formation of embryotoxic metabolites during the incubation with murine hepatocytes is evident. Within the twelve-hour incubation 44 to 77% of CPA was metabolised. The amount of embryotoxic CPA metabolites formed during this incubation period induced a 50-fold decrease of the ID50, compared to the corresponding ID50 after testing non-metabolised CPA in the EST for ten days. After a six- and twelve-hour incubation period with murine hepatocytes, VPD was not sufficiently activated (e.g. to the teratogenic metabolite VPA) to decrease stem cell differentiation. In contrast, VPA formation was significantly enhanced after incubation of VPD with human hepatocytes. This result emphasizes the relevance of interspecies variations in drug metabolism.   In the present study, CPA was identified as a proteratogenic substance by the successful combination of the conventional EST with primary murine hepatocytes. Furthermore, a definite inhibitory concentration of the stem cell differentiation could be determined by testing a concentration series of the test compound. In contrast, since VPD was deficiently activated, its proteratogenic potential could not be determined by combining murine hepatocytes with the EST. To enlarge the data base by testing more substances, a further optimization of the test system is recommended based on species differences in the bioactivation of proteratogens. It is suggested to consider human or porcine metabolic systems for this approach. As is the case of this study, utilisation of primary cell culture material is based on the sacrifice of animals. However, the use of isolated liver cells avoids in vivo studies, including the potential risk of animal suffering. Additionally, the possibility of using several concentrations of a test compound over a period of time of several days offers an immense advantage compared to in vivo testing. Finally, in this study a promising alternative in vitro approach to detect proteratogens has been developed, which needs further evaluation. By combining metabolically competent cells with the EST an improved prediction of the proteratogenic potential of substances is feasible and by doing so the reduction of animal testing is simultaneously promoted.

Um mittels In-vitro-Methoden Hinweise auf das teratogene Potenzial von Substanzen zu erhalten, die erst nach ihrer metabolischen Aktivierung eine fruchtschädigende Wirkung entfalten (sog. Proteratogene), ist die Gegenwart biotransformierender Enzyme entscheidend. Viele alternative Testsysteme wie der validierte Embryonale Stammzelltest (EST) verfügen nicht über eine entsprechende metabolische Kompetenz. Daher sollte mit dieser Arbeit die Realisierbarkeit einer Kopplung von exogener Substanzmetabolisierung mit der Zellkultur untersucht werden. Als Biotransformationssysteme kamen dabei die primäre Leberzellkultur sowie die subzelluläre Leberfraktion S9, als Zielzell-Systeme F9-Zellen und der EST zur Anwendung. Während die Verwendung des S9-Mix im AMES-Test zur Routine gehört, wurde seine potenzielle zytotoxische Wirkung auf Säugerzellen in dieser Arbeit mit F9-Zellen bestätigt. Durch die Aufarbeitung der S9-Fraktion mittels thermischer Denaturierung und Festphasenextraktion konnte ihre Zytotoxizität reduziert werden, wodurch nach einer Inkubation der F9-Zielzellen mit diesen S9-Ansätzen hohe Viabilitäten zu beobachten waren. Über die GC-MS-Analytik wurde nach der Inkubation mit der S9-Fraktion die metabolische Aktivierung des Proteratogens Valpromid (VPD) zum teratogenen Metaboliten VPA nachgewiesen. Die erhaltenen VPA-Konzentrationen waren jedoch zu gering, um im pRSV-Luc-Reportergen-Assay eine Induktion der Luciferaseaktivität hervorzurufen. Weiterführende Untersuchungen könnten Aufschluss darüber geben, in welchem Maße mit dieser Methodik die metabolische Aktivierung anderer Proteratogene stattfindet und inwieweit der S9-Mix zur Verknüpfung mit weiteren In-vitro-Methoden wie dem EST geeignet ist. Die Untersuchung des Cyclophosphamid (CPA) im EST ohne metabolische Aktivierung führte nach dem Prädiktionsmodell (PM) zu der Klassifizierung „schwach embryotoxisch“. Ergänzend wurde überprüft, inwieweit die Herausbildung der embryonalen Aggregate während der Hanging-Drop-Kultur unter Ausschluss einer Substanzexposition durchgeführt werden kann, ohne dass sich abweichende Ergebnisse hinsichtlich der Stammzelldifferenzierung ergeben. Im positiven Fall ergäbe dies günstige Rahmenbedingungen zur Co-Kultivierung des ESTs mit einem metabolisch aktivierenden System unter Verwendung von Transwells. Im Vergleich zum Ergebnis nach dem validierten EST-Protokoll ergab jedoch eine siebentägige Testung des CPA eine wesentlich höhere ID50-Konzentration, woraus eine falsch negative Klassifizierung des CPA im PM resultierte. Mit den Untersuchungen des VPD und der VPA im EST wurde ein entsprechender Effekt auf die Halbhemmkonzentration der Stammzelldifferenzierung nach verkürzter Substanzzugabe gefunden. Nach dem klassischem EST-Protokoll wurden mit dem PM sowohl das VPD als auch die VPA als schwach embryotoxische Substanzen eingestuft, obwohl in vivo die VPA als teratogener Metabolit des VPD eine deutlich stärkere fruchtschädigende Potenz als das VPD zeigt. Da im EST jedoch der ID50-Wert der VPA eine wesentlich geringere Konzentration aufwies als der entsprechende Wert des VPD, konnte durch den Vergleich dieser beiden Endpunkte auch in vitro die stärkere Teratogenität der VPA nachgewiesen werden. Zur Kombination von primären Hepatozyten der Maus mit dem EST wurden die Leberzellen mit Stammzellmedium kultiviert, welches reduzierte Mengen an Inhaltsstoffen (z. B. FBS, 2-Mercaptoethanol) enthielt. Dadurch konnte für sechs Stunden inkubierter Kulturüberstand im EST eingesetzt werden, ohne einen hemmenden Einfluss auf die Differenzierungsrate der ES-D3-Zellen zu verursachen. Eine maximal mögliche Inkubationszeit von zwölf Stunden ergab sich bei der verkürzten Testung des Kulturüberstandes im EST für sieben Tage. Bezüglich der Zytotoxizitätsbestimmung war unter Verwendung des Leberzellüberstandes allerdings das regelmäßige Auftreten kontaminierter Wells im EST zu beobachten, die eine Auswertung der MTT-Assays nicht zuließen. Das Proteratogen CPA wurde während der sechsstündigen Inkubation zu 30 bis 60 % metabolisch umgesetzt, seine nachfolgende Untersuchung im Differenzierungsassay des ESTs ergab eine um den Faktor 70 geringere ID50-Konzentration. Damit konnte der Nachweis geliefert werden, dass das CPA durch murine Hepatozyten zu embryotoxischen Metaboliten aktiviert worden war, die eine drastische Senkung der ID50-Konzentration herbeiführten. Durch die zwölfstündige Inkubation war ein CPA-Umsatz von 44 bis 77 % erhalten worden. Dabei entstanden Konzentrationen embryotoxischer Stoffwechselprodukte, die im Vergleich zur zehntägigen Testung des nicht präinkubierten CPA noch eine um den Faktor 50 geringere ID50-Konzentration hervorriefen. Das Proteratogen VPD wurde weder nach einer sechs- noch nach einer zwölfstündigen Inkubationszeit durch die Maushepatozyten ausreichend metabolisch aktiviert, um im Differenzierungsassay des ESTs einen vermindernden Effekt auf die Halbhemmkonzentration der ES-D3-Differenzierung auszuüben. Anhand einer vergleichenden Inkubation mit Leberzellen des Menschen konnte eine vielfach höhere Aktivierungsrate des Proteratogens VPD zu seinem teratogenen Metaboliten VPA gezeigt werden. Dieser Befund verdeutlicht die Relevanz von Unterschieden bezüglich der metabolischen Kompetenz zwischen den Spezies.   Durch eine erfolgreiche Kombination von primären murinen Leberzellen mit dem EST konnte das CPA als Proteratogen identifiziert werden. Die Testung einer Konzentrationsreihe ermöglichte dabei die Bestimmung der proteratogenen Eigenschaft des CPA unter Ermittlung konkreter Halbhemmkonzentrationen der Stammzelldifferenzierung. Auf Grund einer zu geringen metabolischen Aktivierung der Testsubstanz VPD konnte die Aufdeckung seines proteratogenen Potenzials durch die Verknüpfung der Mausleberzellen mit dem EST nicht erfolgen. Zur Berücksichtigung der spezies-spezifischen Metabolisierung ist für die anzustrebende Datenbasiserweiterung des neu entwickelten metabolisch aktiven ESTs verstärkt die Verwendung humaner bzw. alternativ porciner Aktivierungssysteme zu empfehlen. Wie schon bei der Kombination von primären Leberzellen mit dem EST in dieser Arbeit wäre auch mit der zukünftigen Verwendung primären Zellkulturmaterials tierischer Herkunft die Tötung von Tieren notwendig. Große Vorteile gegenüber der In-vivo-Testung bestehen jedoch darin, dass mit der Isolierung von Leberzellen keine Tierversuche mit eventuellen Leiden für die Labortiere durchgeführt werden müssen, und dass mit einer einzigen Leberzellisolierung eine Vielzahl an Substanzkonzentrationen über mehrere Tage geprüft werden können. Schlussendlich konnte mit dieser Arbeit eine viel versprechende Test-Methode zur Detektion von Proteratogenen entwickelt werden, deren weitere Evaluierung anzustreben ist. Die Kombination von metabolisch kompetenten Zellen mit dem EST kann eine entscheidend bessere Prädiktion des teratogenen Potenzials von Chemikalien ermöglichen und gleichzeitig als Alternativmethode einen wertvollen Beitrag zur Reduzierung von Tierversuchen leisten.

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Hettwer, Michael: Metabolische Aktivierung von Proteratogenen zur Erweiterung von In-vitro-Systemen. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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