Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Bovines Calgranulin A und B

Koy, Mirja

The calgranulins A (S100A8) and B (S100A9) have been associated with acute and chronic inflammatory disorders and are found at high levels in inflamed tissue. Being discussed as DAMPs (damage-associated molecular patterns) S100A8 and A9 are expressed either constitutive or induced by a large number of cells including neutrophils, certain macrophages, fibroblasts as well as endothelial and epithelial cells. Both calgranulins display microbicidal activities and are supposed to modulate a wide variety of immune relevant processes including immune cell adhesion and migration, although existing data are inconsistent concerning the chemotactic properties of S100A8 and S100A9 in humans and rodents. The effects of calgranulin A and B in the bovine immune system are widely unknown. The aim of the present study was to evaluate the meaning of S100A8 and S100A9 to bovine neutrophil granulocyte and endothelial cell functions. The overexpression of calgranulin A and B was achieved in Escherichia coli strain BL21 (DE 3) and protein purification was performed by FPLC (fast protein liquid chromatography). HEK cells, co-transfected with bovine TLR4, MD2, CD14 und NF-κB, showed no significant NF‑κB induction after incubation with rbS100A8 and rbS100A9. Therefore, these proteins cannot be classified as agonistic TLR4 ligands in the bovine system. Additionally, neither rbS100A8 nor rbS100A9 nor the equivalent mixture of both could activate PMN in low (10-12 – 10-15 g/mL) or high (10-5 – 10-9 g/mL) concentrations, as seen after incubation with chemokines (here: Interleukin-8) or PAMPs (here: LPS) followed by shape change analyses. Even in indirect stimulation assays in the presence of mononuclear cells no effect could be detected. The missing and inconsistent activation of PMN could also be observed in Ca2+-Influx studies. Recombinant bovine S100A8, S100A9 and the mixture of both revealed no modulation of PMN-migration in vitro when used at concentrations between 10-5 ‑ 10‑15 g/mL. In accordance, PMN viability was equally not affected, at least under those culture conditions used in these studies. Evidence for their modulating capacity was found, when primary bovine endothelial cell (bEC) cultures were coincubated with LPS (1 µg/mL) and the calgranulins (100 ng/mL, mixture 50 ng/mL each). Such bEC supernatants displayed a reduced potential to stimulate Ca2+-Influx into PMN and a reduced potential to attract PMN in migration assays in vitro. This LPS diminishing effect, observed for both recombinant calgranulins and the mixture of both, was deduced to a capture of LPS by these proteins or binding of them to an unknown receptor. Correlating these functionally assessed effects from bEC-supernatants with mRNA expression of these cells, a clear evidence for a Calgranulin permitted reduction from LPS induced expression of Interleukin-6 and Interleukin-1β could be shown, whereas Interleukin‑8 and ICAM-1 were moderately increased, when compared to incubation with LPS alone. The recombinant bovine calgranulins proved to predominantly function as anti-inflammatory agents. Partly heterogenous effects lead to the assumption, that the modulation of inflammatory events by rbS100A8 or rbS100A9 might reflect the complex interaction of several factors, as cell type, inflammatory environment, receptor accessibility and/or posttranslational modifications. Promising insights into the tuning of inflammation by bovine calgranulins are given by the altered production of pro-inflammatory mediators in the bEC-PMN-model. This suggests further studies which should focus on the EC as the first barrier for blood emigrating effector cells of the immune system.

Die zu den S100-Proteinen gehörenden Calgranuline A (S100A8) und B (S100A9) werden u. a. konstitutiv in hohen Mengen in neutrophilen Granulozyten exprimiert und im Entzündungsgeschehen nach deren Nekrose in den Extrazellularraum entlassen. Beiden Proteinen kommen dort und auch intrazellulär vielschichtige Aufgaben zu. In der Literatur werden sie sowohl zu den pro- als auch zu den anti-inflammatorischen Mediatoren gezählt. Für die Maus sind sie als endogene TLR4-Liganden beschrieben. Zudem sind sie wie HMGB1 (high-mobility group box 1) und HSPs (heat shock proteins) weitgehend als DAMPs (damage-associated molecular patterns) akzeptiert. Ihre chemotaktische Wirkung auf Immunzellen bei Mensch und Maus wird wiederum kontrovers diskutiert. Die Wirkungen der Calgranuline A und B auf bovine Immunzellen sind bisher nicht erforscht. Aus diesem Grund wurden sie im ersten Teil der Arbeit erfolgreich im Escherichia coli-Stamm BL21 (DE 3) überexprimiert und anschließend mittels FPLC (fast protein liquid chromatography) aufgereinigt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die rekombinanten Calgranuline in Bindungsstudien und in Versuchen, die Funktionalität neutrophiler Granulozyten betreffend, hochrein eingesetzt. In HEK-Zellen, die mit dem bovinen TLR4, MD2, CD14 und NF-κB co‑transfiziert wurden, führten die rekombinanten Calgranuline zu keiner NF-κB-Aktivierung. Damit können diese Moleküle beim Rind nicht als TLR4-Liganden klassifiziert werden. Ebenso führte weder rbS100A8, rbS100A9 noch das äquivalentanteilige Gemisch rbS100A8‑A9 in niedrigeren (10-12 – 10-15 g/mL) und höheren (10-5 – 10-9 g/mL) Konzentrationen direkt oder indirekt über die Stimulation von mononukleären Zellen zur Aktivierung von neutrophilen Granulozyten, wie es über die Zellgrößenänderung (shape change) durch ein Chemokin (Interleukin-8, CXCL8) oder ein Pathogen-assoziiertes molekulares Muster (LPS, Lipopolysaccharid) statistisch signifikant nachweisbar war. Diese fehlende und inkohärente Aktivierung von Granulozyten spiegelte sich ebenso in der fehlenden Induktion eines Calcium-Einstroms in Leukozyten wider. RbS100A8, rbS100A9 oder rbS100A8-A9 führten im Konzentrationsbereich von 10-5 – 10-15 g/mL auch nicht zu einer direkten Modulation der In vitro-Migration boviner PMN und hatten unter den gewählten Kulturbedingungen keinen Einfluss auf die Vitalität neutrophiler Granulozyten in vitro. Wurden Endothelzellen (bovine vaskuläre endotheliale Zellen) mit LPS (1 µg/mL; 24 h) stimuliert, so konnte die Anwesenheit der rekombinanten Calgranuline (100 ng/mL) sowohl die Calcium-Einstrom-induzierende Potenz als auch das Migrations-induzierende Potenzial für neutrophile Granulozyten der Zellkulturüberstände reduzieren. Dass die beiden rekom-binanten Calgranuline sowie deren äquivalentanteiliges Gemisch die durch LPS-Stimulation ausgelösten Effekte auf Endothelzellen reduzieren konnten, wurde unter der Annahme der LPS-Bindung durch die rekombinanten Proteine oder durch deren Bindung an einen nicht identifizierten Rezeptor diskutiert. Die funktionellen Effekte der Zellkulturüberstände korrelieren auf Endothelzell-mRNA-Ebene mit einer durch die Calgranuline bewirkten Reduktion der LPS-induzierten Expression von Interleukin-6 und Interleukin-1β, während Interleukin-8 und ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1) im Vergleich mit der alleinigen LPS-Stimulation moderat hoch reguliert wurden. Die rekombinanten bovinen Calgranuline erwiesen sich als überwiegend anti-inflammatorisch wirksam. Die z. T. heterogenen Ergebnisse lassen vermuten, dass es sich bei der Modulation des Entzündungsgeschehens durch Calgranulin A und B um komplexe Interaktionen verschiedener Faktoren, wie Zelltyp, inflammatorischem Milieu, Rezeptorverfügbarkeit und post-translationaler Modifikation handelt. Die tendenzielle Reduktion entzündungsfördernder Mediatoren im gewählten Endothelzell-Granulozyten-Modellsystem gewährt einen vielversprechenden Einblick in die Entzündungsmodulation durch bovine Calgranuline. Es gilt dies durch weiterführende Studien zu erhärten, in denen die Endothelzellen als erste zelluläre Barriere für aus dem Blut emigrierende Effektorzellen des Immunsystems im Zentrum stehen sollten.

Preview

Quote

Citation style:

Koy, Mirja: Bovines Calgranulin A und B. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export