Bovines Calgranulin A und B

Die zu den S100-Proteinen gehörenden Calgranuline A (S100A8) und B (S100A9) werden u. a. konstitutiv in hohen Mengen in neutrophilen Granulozyten exprimiert und im Entzündungsgeschehen nach deren Nekrose in den Extrazellularraum entlassen. Beiden Proteinen kommen dort und auch intrazellulär vielschichtige Aufgaben zu. In der Literatur werden sie sowohl zu den pro- als auch zu den anti-inflammatorischen Mediatoren gezählt. Für die Maus sind sie als endogene TLR4-Liganden beschrieben. Zudem sind sie wie HMGB1 (high-mobility group box 1) und HSPs (heat shock proteins) weitgehend als DAMPs (damage-associated molecular patterns) akzeptiert. Ihre chemotaktische Wirkung auf Immunzellen bei Mensch und Maus wird wiederum kontrovers diskutiert. Die Wirkungen der Calgranuline A und B auf bovine Immunzellen sind bisher nicht erforscht. Aus diesem Grund wurden sie im ersten Teil der Arbeit erfolgreich im Escherichia coli-Stamm BL21 (DE 3) überexprimiert und anschließend mittels FPLC (fast protein liquid chromatography) aufgereinigt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die rekombinanten Calgranuline in Bindungsstudien und in Versuchen, die Funktionalität neutrophiler Granulozyten betreffend, hochrein eingesetzt. In HEK-Zellen, die mit dem bovinen TLR4, MD2, CD14 und NF-κB co‑transfiziert wurden, führten die rekombinanten Calgranuline zu keiner NF-κB-Aktivierung. Damit können diese Moleküle beim Rind nicht als TLR4-Liganden klassifiziert werden. Ebenso führte weder rbS100A8, rbS100A9 noch das äquivalentanteilige Gemisch rbS100A8‑A9 in niedrigeren (10-12 – 10-15 g/mL) und höheren (10-5 – 10-9 g/mL) Konzentrationen direkt oder indirekt über die Stimulation von mononukleären Zellen zur Aktivierung von neutrophilen Granulozyten, wie es über die Zellgrößenänderung (shape change) durch ein Chemokin (Interleukin-8, CXCL8) oder ein Pathogen-assoziiertes molekulares Muster (LPS, Lipopolysaccharid) statistisch signifikant nachweisbar war. Diese fehlende und inkohärente Aktivierung von Granulozyten spiegelte sich ebenso in der fehlenden Induktion eines Calcium-Einstroms in Leukozyten wider. RbS100A8, rbS100A9 oder rbS100A8-A9 führten im Konzentrationsbereich von 10-5 – 10-15 g/mL auch nicht zu einer direkten Modulation der In vitro-Migration boviner PMN und hatten unter den gewählten Kulturbedingungen keinen Einfluss auf die Vitalität neutrophiler Granulozyten in vitro. Wurden Endothelzellen (bovine vaskuläre endotheliale Zellen) mit LPS (1 µg/mL; 24 h) stimuliert, so konnte die Anwesenheit der rekombinanten Calgranuline (100 ng/mL) sowohl die Calcium-Einstrom-induzierende Potenz als auch das Migrations-induzierende Potenzial für neutrophile Granulozyten der Zellkulturüberstände reduzieren. Dass die beiden rekom-binanten Calgranuline sowie deren äquivalentanteiliges Gemisch die durch LPS-Stimulation ausgelösten Effekte auf Endothelzellen reduzieren konnten, wurde unter der Annahme der LPS-Bindung durch die rekombinanten Proteine oder durch deren Bindung an einen nicht identifizierten Rezeptor diskutiert. Die funktionellen Effekte der Zellkulturüberstände korrelieren auf Endothelzell-mRNA-Ebene mit einer durch die Calgranuline bewirkten Reduktion der LPS-induzierten Expression von Interleukin-6 und Interleukin-1β, während Interleukin-8 und ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1) im Vergleich mit der alleinigen LPS-Stimulation moderat hoch reguliert wurden. Die rekombinanten bovinen Calgranuline erwiesen sich als überwiegend anti-inflammatorisch wirksam. Die z. T. heterogenen Ergebnisse lassen vermuten, dass es sich bei der Modulation des Entzündungsgeschehens durch Calgranulin A und B um komplexe Interaktionen verschiedener Faktoren, wie Zelltyp, inflammatorischem Milieu, Rezeptorverfügbarkeit und post-translationaler Modifikation handelt. Die tendenzielle Reduktion entzündungsfördernder Mediatoren im gewählten Endothelzell-Granulozyten-Modellsystem gewährt einen vielversprechenden Einblick in die Entzündungsmodulation durch bovine Calgranuline. Es gilt dies durch weiterführende Studien zu erhärten, in denen die Endothelzellen als erste zelluläre Barriere für aus dem Blut emigrierende Effektorzellen des Immunsystems im Zentrum stehen sollten.