Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molecular and cellular mechanisms of axonal pathology in Theilerś murine encephalomyelitis virus-induced demyelination

Kreutzer, Mihaela

Theiler’s murine encephalomyelitis virus-induced demyelination (TMEV-ID) is, beside canine distemper virus encephalitis, one of the best known viral murine models of multiple sclerosis (MS), a human immune-mediated demyelinating disease of the central nervous system affecting over 2.5 million individuals. MS and TMEV-ID share common pathological features characterized by a delayed and incomplete remyelination and prominent axonal pathology. The axonal damage correlates with the observed neurological deficits and is responsible for the irreversible clinical outcome. Therefore the goal of any therapeutic approach should include maintenance of physiologic-like conditions inside and outside the axons. The following two aspects of TMEV-ID pathogenesis were investigated in the present study: (i) a possible dysregulation of oligodendroglial progenitor cells (OPCs) differentiation which could be responsible for insufficient regeneration and (ii) modifications in the axonal transport and protein degradation which could cause non-phosphorylated neurofilaments accumulation and a progressive axonopathy. The aim of the first part of the thesis was based on the hypothesis that a dysregulation of differentiation of OPCs represents the main cause of insufficient regeneration in TMEV-ID. Clinically, footprint analysis revealed a significantly decreased stride length at 147 and 196dpi. Pathologically, a progressive demyelination was observed beginning with 14dpi until 196dpi. A mild amount of remyelination was detected at 147 and 196dpi. Early onset axonal injury was detected from 14dpi on. Intralesional nerve/glial antigen 2 (NG2)-positive OPCs were temporarily increased between 28 and 98dpi. Similarly, a transient upregulation of NG2 and platelet-derived growth factor α-receptor mRNA was noticed. In contrast, intralesional CNPase-positive oligodendrocytes were decreased between 56 and 196dpi. Although CNPase mRNA remained unchanged, myelin basic protein mRNA and especially its exon 2 containing splice variants were decreased. GFAP-positive astrocytes and GFAP mRNA were increased in the late phase of TME. A mildly increased colocalization of both NG2/CNPase and NG2/GFAP was revealed at 196dpi. Thus, findings indicated that a dysregulation of OPC differentiation by unknown directly or indirectly TMEV-related factors seems to represent a dominating pathogenetic mechanism causing delayed and limited remyelination in TMEV-ID. For the second part of the thesis the underlying hypothesis was that the initiation and development of TMEV-induced axonopathy are based on an impaired axonal transport of NFs. Therefore, molecular processes involved in axonal accumulation of non-phosphorylated neurofilament in TMEV-ID, were analyzed in detail. The accumulation of non-phosphorylated neurofilaments showed a temporal development due to sequential impairments of the bidirectional axonal traffic consisting of the down-regulation of kinesin family member 5A, dynein cytoplasmic heavy chain 1, tau-1 and β-tubulin III expression. In addition, alterations of the neuronal protein metabolism, including down-regulation of ubiquitin-protein conjugates and ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1, causing diminished degradation of non-phosphorylated neurofilament, were noticed. In addition, in vitro experiments showed a direct role of the virus for these modifications and the morphological manifestation of the axonal degeneration expressed as tandem-repeated swellings in neuroblastoma N1E-115 cell line after infection with TMEV. Thus, neurofilament accumulation in TMEV-ID seems to be the result of specific dysregulations in the axonal transport mediated by Kif5A and also the sequel of nonspecific impairments in the neuronal protein metabolism including the ubiquitin-protein conjugates. During TMEV-ID progression, a damaged axon could be a triggering signal for the dysregulation of OPC differentiation that may cause additional axonal injuries and a delayed and incomplete remyelination. The presented findings may have important implications for our understanding of molecular mechanisms responsible for initiation and development of axonopathies in neurodegenerative disorders.

Die durch das murine Theiler-Enzephalomyelitis-Virus induzierte Demyelinisierung (Theiler’s murine encephalomyelitis virus-induced demyelination [TMEV-ID]) ist neben der kaninen Staupeenzephalitis eines der am Besten bekannten viralen Tiermodelle für die Multiple Sklerose (MS) des Menschen. Bei der MS handelt es sich um eine immunvermittelte demyelinisierende Erkrankung des zentralen Nervensystems, welche weltweit ca. 2,5 Millionen Menschen betrifft. MS und TMEV-ID zeigen gleichartige pathologische Merkmale, die durch eine verzögerte und unzureichende Remyelinsierung sowie prominente Axonschädigungen charakterisiert sind. Die Alterationen bzw. der Verlust von Axonen bedingt in großem Maße die Symptomatik sowie den irreversiblen klinischen Verlauf. Aus diesem Grund sollte das Ziel möglicher therapeutischer Ansätze die Aufrechterhaltung der physiologischen Konditionen der Axonstruktur als auch des axonalen Umfelds beinhalten. Die folgenden zwei Aspekte der Pathogenese der TMEV-ID wurden in der vorliegenden Studie untersucht: i) die mögliche Dysregulation der Differenzierung oligodendroglialer Vorläuferzellen (oligodendroglial progenitor cells [OPCs]), welche für die unzureichende Regeneration verantwortlich sein kann sowie ii) Veränderungen im axonalen Transport und Proteindegradation, welche zu einer Ablagerung von nicht-phosphorilierten Neurofilamenten und somit zu progressiven Axonopathien beitragen können. Zur Klärung der ersten Fragestellung, nämlich inwiefern die Dysregulation der Differenzierung der OPCs eine Ursache der mangelhaften Remyelinisierung darstellt, wurden sowohl molekularbiologische als auch pathomorphologische bzw. immunhistologische Untersuchungen an TMEV-infizierten Mäusen sowie Placebo-Tieren durchgeführt. Zusätzlich fand eine klinische Untersuchung der Tiere in Form einer Schrittlängenmessung statt. Hierbei zeigte sich eine signifikant verringerte Schrittlänge der TMEV-infizierten Tiere gegenüber den Placebo-Tieren 147 und 196 Tage post infectionem (dpi). Morphologisch war in den Rückenmärkern eine progressive Demyelinisierung in der Zeitspanne von 14 bis 196 dpi zu detektieren. Eine geringgradige Remyelinisierung war zum Zeitpunkt 147 und 196 dpi aufzufinden. Eine Axonschädigung zeigte sich bereits ab 14 dpi. Ein vermehrtes intraläsionales Auffinden von „nerve/glial antigen 2“ (NG2)-positiven OPCs war zwischen 28 und 98 dpi nachzuweisen. Weiterhin zeigte sich eine transiente Aufregulierung von NG2- und „platelet-derived growth factor α-receptor“-mRNS. Im Gegensatz dazu war die intraläsionale Anzahl CNPase-positiver Oligodendrozyten im Zeitraum zwischen 56 und 196 dpi vermindert. Obwohl der Gehalt von CNPase-mRNS unverändert blieb, war die Menge an mRNA des basischen Myelinproteins und insbesondere seiner Exon 2-Splicevariante vermindert. Weiterhin zeigte sich ein Anstieg von GFAP-positiven Astrozyten sowie GFAP-mRNA in der Spätphase der TMEV-Infektion. Eine geringgradige vermehrte Kolokalisation von NG2/CNPase sowie NG2/GFAP wurde zum Zeitpunkt 196 dpi festgestellt. Diese Ergebnisse deuten auf eine Dysregulation der Differenzierung der OPCs und damit auf eine konsekutive verzögerte und unzureichende Remyelinisierung hin. Ursächlich müssen hierfür direkte als auch indirekte TMEV-abhängige Faktoren in Betracht gezogen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Hypothese untersucht, inwiefern die durch die TMEV-Infektion induzierten Axonschädigungen auf einem gestörten axonalen Transport von Neurofilamenten basieren. Die Akkumulation von nicht-phosphorilierten Neurofilamenten entwickelte sich über die Zeit des Versuchs wahrscheinlich durch eine Beeinträchtigung des bidirektionalen axonalen Transports. Diese zeichnete sich durch eine verminderte Expression von Kinesin 5 A, der zytoplasmatischen schweren Kette 1 des Dyneins, Tau-1 und β-Tubulin III aus. Zusätzlich waren Alterationen des Proteinabbaus in Form einer verminderten Expression von Ubiquitin-Protein-Konjugaten sowie der Ubiquitin-Carboxy-terminalen Hydrolase L1 sichtbar. Infolgedessen ist eine verringerte Degradation der nicht-phosphorilierten Neurofilamente wahrscheinlich. Zusätzlich konnte durch in vitro-Experimente eine direkte Rolle des TMEV für die morphologische Ausprägung des Axonschadens aufgezeigt werden. Dieser manifestierte sich als sogenannte „tandem repeats“ in Zellen der Neuroblastoma N1E-115 Zelllinie nach Infektion mit TMEV. Abschließend lässt sich aus pathogenetischer Sicht vermuten, dass während der TMEV-Infektion ein geschädigtes Axon möglicherweise die Dysregulation der Differenzierung der OPCs induziert, welche konsekutiv weitere Axonopathien nach sich zieht und auch für die verspätete und unzureichende Remyelinisierung verantwortlich ist. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen geben erste Einblicke in molekulare und zelluläre Mechanismen, welche für die Pathogenese von axonalen Schäden verantwortlich sind.

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Kreutzer, Mihaela: Molecular and cellular mechanisms of axonal pathology in Theilerś murine encephalomyelitis virus-induced demyelination. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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