Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

C18-Furanfettsäuren Toxikologische Charakterisierung der Oxidationsprodukte von konjugierten Linolsäureisomeren

Lengler, Imme

Conjugated linoleic acids (CLA) are polyunsaturated fatty acids and offer a variety of physiological effects. Recent studies revealed the anticarcinogenic properties of the minor isomer t10,c12-CLA. The average estimated intake of CLA via milk products and meat from ruminants by humans is 0.3 g CLA/day. The European Food Safety Authority currently proves the application for approval of food supplements which could result in a tenfold increase of daily CLA intake. In addition, ingestion of these supplements could lead to a simultaneous increased uptake of CLA oxidation products, the furan fatty acids (FFA). The physiological effects of high concentrations of CLA and of their oxidation products are unknown. In this study the cellular and molecular effects of FFA in comparison to CLA were characterised for the first time. As CLA are known to have antiproliferative effects and to induce differentiation in particular in human colon carcinoma cells the colorectal adenocarcinoma cell line Caco-2 was used as in vitro model. In the first part of this study, molecular effects caused by t10,c12-CLA were compared with those caused by the corresponding 10,12-FFA in Caco-2 cells. By using two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry (MALDI-TOF) a detailed overview of proteomic changes after exposure of Caco-2 cells to these fatty acids was achieved. Treatment of the cells with up to 100 µM t10,c12-CLA led to the identification of 40 proteins with a more than 1.5-fold altered expression in comparison to untreated control cells. These data revealed a detailed insight into the antiproliferative mechanism initiated by CLA. On the one hand, t10,c12-CLA regulated proteins which are involved in improvement of transcription, translation, stability and activity of p53 protein. This indicates p53-mediated tumor suppression triggered by t10,c12-CLA. On the other hand potential regulatory proteins of the Wnt/β‑catenin signaling pathway were affected. Moreover, target genes of the same pathway were inhibited. This suggests an inhibition of Wnt/β‑catenin signaling through t10,c12-CLA. Repression of this signaling pathway results in a decrease of cellular proliferation and a stimulation of cellular differentiation. Therefore, the data correlate with the postulated anticarcinogenic effect of this substance. In case of 10,12-FFA, 30 differentially expressed proteins were identified upon incubation of Caco-2 cells with up to 1 mM of the substance. However, these proteins completely differed from those regulated by t10,c12-CLA. Three proteins were upregulated and these proteins were associated with lipid droplet biogenesis. All remaining differentially expressed proteins were downregulated. They were considered to be associated with the cell cycle as well as with general cellular processes such as transcription, protein biosynthesis and further protein processing. There was no indication that any signal transduction pathway of toxicological relevance was affected by 10,12-FFA. In the second part of this study cellular effects of different FFA isomers were studied by using the Caco-2 model. Based on the assumption that the furan ring of FFA might be activated in the liver by cellular metabolic activity, the metabolically active human hepatoma cell line HepG2 was included in the study. It was shown with Caco‑2 cells that FFA was taken up and stored as triglycerides in intracellular lipid droplets. FFA showed neither in Caco-2 nor in HepG2 cells toxic effects at concentrations that could be relevant for humans. At concentrations up to 500 µM, the FFA isomers showed no pronounced cytotoxicity and did not influence cellular proliferation or apoptosis. Moreover, FFA did not interact with proxisome proliferator-activated receptors, which are activated by many fatty acids and which are supposed to be involved in carcinogenesis. Additionally, 9,11-FFA was neither genotoxic in the micronucleus test using Chinese hamster lung fibroblasts (V79) nor in the Ames test. In summary, t10,c12-CLA have an impact on relevant signal transduction pathways in colon carcinoma cells whereas oxidation products of CLA neither have toxic cellular effects nor affect significant molecular signaling pathways.

Konjugierte Linolsäureisomere (conjugated linoleic acid, CLA) sind mehrfach ungesättigte Fettsäuren, die vielfältige physiologische Wirkungen besitzen. Bisherige Studien zeigen, dass insbesondere das Minorisomer t10,c12-CLA eine antikarzinogene Wirkung besitzt. Der Mensch nimmt über Milchprodukte und Fleisch von Wiederkäuern durchschnittlich 0,3 g CLA pro Tag zu sich. Der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit liegen derzeit Zulassungsanträge für neuartige Lebensmittelzutaten vor, die die tägliche Aufnahme an CLA verzehnfachen könnten. Bei einer Einnahme dieser Präparate ist gleichzeitig von einer erhöhten Aufnahme von Oxidationsprodukten der CLA, den Furanfettsäuren (FFA), auszugehen. Die physiologischen Auswirkungen derartig gesteigerter Mengen CLA und ihrer Oxidationsprodukte sind nicht bekannt. In dieser Arbeit wurden die zellulären und molekularen Effekte der FFA im Vergleich zu denen der CLA erstmalig charakterisiert. Da für CLA insbesondere in humanen Kolonkarzinomzellen antiproliferative und differenzierungsfördernde Effekte beschrieben sind, wurde die Kolon-Adenokarzinomzelllinie Caco-2 als in vitro-Modell verwendet. Im ersten Teil der Arbeit wurden die molekularen Wirkungen der t10,c12-CLA in Caco-2-Zellen denen der strukturell zugehörigen 10,12-FFA gegenübergestellt. Mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese und Massenspektrometrie (MALDI-TOF) wurden die proteomischen Veränderungen nach Einwirkung dieser Fettsäuren analysiert. Nach der Behandlung von Caco-2-Zellen mit bis zu 100 µM t10,c12-CLA wurden 40 Proteine mit mindestens 1,5fach veränderter relativer Expression im Gegensatz zur Kontrolle identifiziert. Zum Einen wurden durch die CLA-Behandlung Proteine beeinflusst, die die Transkription, Translation, Stabilität oder Aktivität von p53 steigern, was auf eine p53-vermittelte Tumorsuppression hinweist. Zum Anderen wurden sowohl potentielle Regulatoren des Wnt-β-Catenin-Signalwegs beeinflusst als auch Zielgene dieses Signalweges inhibiert. Dieses konnte als negative Regulierung des Wnt-β-Catenin-Signalweges durch die t10,c12-CLA interpretiert werden. Eine Inhibierung dieses Signalweges hat eine Abnahme der zellulären Proliferation und eine Stimulation der Differenzierung der Zellen zur Folge und korreliert somit mit der postulierten antikanzerogenen Wirkung dieser Substanz. Nach Exposition von Caco-2-Zellen mit bis zu 1 mM 10,12-FFA wurden 30 differenziell exprimierte Proteine identifiziert, die jedoch komplett andere Effekte im Vergleich zur korrespondierenden t10,c12-CLA anzeigten. Es wurden drei Proteine induziert, die eine Rolle in der Lipidtröpfchenbiogenese spielen. Alle anderen durch die 10,12-FFA regulierten Proteine waren reprimiert und betrafen den Zellzyklus sowie allgemeine zelluläre Prozesse wie die Transkription, Protein­biosynthese und die weitere Prozessierung von Proteinen. Eine Beeinflussung toxikologisch relevanter Signalwege durch die 10,12-FFA wurde nicht gefunden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die zellulären Effekte verschiedener FFA-Isomere in Caco-2-Zellen untersucht. Unter Berücksichtigung einer möglichen metabolischen Aktivierung des Furanringes der FFA in der Leber wurden die Untersuchungen auf die metabolisch aktive humane hepatozelluläre Karzinomzelllinie HepG2 ausgedehnt. Es wurde gezeigt, dass die FFA in Caco-2-Zellen aufgenommen und intrazellulär in Lipidtröpfchen verpackt wurden, in humanrelevanten Konzentrationen jedoch weder in Caco-2- noch in HepG2-Zellen eine toxische Wirkung entfalteten. Bei Konzentrationen bis zu 500 µM wiesen die FFA-Isomere weder eine ausgeprägte Zytotoxizität auf noch beeinflussten sie zelluläre Parameter wie die Proliferation oder Apoptose. Auch die Peroxisomen-Proliferator-aktivierten-Rezeptoren, die durch zahlreiche Fettsäuren aktiviert werden und eine Rolle in der Karzinogenese spielen, wurden durch die FFA nicht beeinflusst. Zudem wies die 9,11-FFA weder in einem in vitro-Mikrokerntest mit Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters (V79-Zellen) noch im Ames-Test eine genotoxische Wirkung auf. Insgesamt geht aus den Ergebnissen dieser Arbeit hervor, dass die t10,c12-CLA relevante Signaltransduktionswege in Darmzellen beeinflusst, wohingegen von den Oxidationsprodukten der CLA weder zellulär toxische Wirkungen ausgehen noch molekulare Signalwege signifikant beeinflusst werden.

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Lengler, Imme: C18-Furanfettsäuren Toxikologische Charakterisierung der Oxidationsprodukte von konjugierten Linolsäureisomeren. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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