Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Influence of Mycoplasma hyopneumoniae strain variation, environmental factors and co-infections on Enzootic Pneumonia in pigs

Nathues, Heiko

Mycoplasma hyopneumoniae is the etiologic agent of porcine enzootic pneumonia and is widespread all over the world leading to endemic infections in regions of intensive pig production. The disease is characterized by a significant economic impact and the current measures of control (vaccination, antimicrobial treatment) can only reduce the clinical symptoms, but cannot prevent the occurrence of the disease itself. Enzootic pneumonia is accepted being a multifactorial disease, where risk factors are primarily comprised by deficiencies in management and housing of pigs. In the past, identification and estimation of potential risks were mainly based on single and empirical observations, which were often assessed with a small number of study subjects. The need of further research is constituted by significant structural developments in the pig production (herd size, spatial separation of production units, pig flow), which work on the spread and the transmission of this pathogen. Today, the improvements of diagnostic methods for the detection of M. hyopneumoniae enable a more thorough assessment of the dynamic of infections within pig herds. Noteworthy, the potency of the occurrence of M. hyopneumoniae strains with different virulence (genetic and phenotypic variability) in pig herds yet has not been considered in field studies. The aim of the present thesis was to comprehensively investigate the influence of M. hyopneumoniae strain variation, various environmental and management factors, as well as the relevance of selected coinfections in pig herds within one project. The overall significance of these factors on clinical manifestation of enzootic pneumonia should be estimated.   In the first part of this project the focus was on the characterization of different strains of M. hyopneumoniae. Therefore, a method was established enabling an easy and rapid identification of porcine mycoplasma species, which were isolated by cultural technique. M. hyopneumoniae, M. hyorhinis, M. hyosynoviae, M. hyopharyngis and M. flocculare were differentiated according to the unique size of their individual amplification products obtained when using 16S-23S-rDNA intergenic spacer region specific PCR. Subsequently, 52 strains of M. hyopneumoniae were isolated and identified from samples of 45 pigs. These pigs originated from 21 herds with or without symptoms of respiratory disease in fattening pigs. In seven cases, M. hyopneumoniae was isolated from both bronchoalveolar lavage fluid and lung tissue of the same pig. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) and variable number of tandem repeats (VNTR) analyses were performed in order to determine the genotype of these strains. Consistent results, which were revealed in both methods, indicated genotypic variability among strains of M. hyopneumoniae isolated from different herds, but also among strains from the same herd. In two pigs, an infection with at least two different strains of M. hyopneumoniae could be confirmed. Conclusions drawn on the outcome of the first part of this thesis include the statement that applied molecular typing methods are of little value, when identification of potential virulence factors is aimed in material from endemic infected pig herds, because circulation of different strains in corresponding herds has to be considered.   In the second part of this project, the diagnostic value of thorough clinical examination including the quantification of clinical symptoms for the purpose of diagnosing enzootic pneumonia in fattening pigs was evaluated. In fattening pigs, dry and non-productive cough is a typical symptom of infection with M. hyopneumoniae. The merit of clinical examination usually was rated low compared to the assessment of typical lung lesions and the direct or indirect detection of M. hyopneumoniae. The objective of the own study was to evaluate a quantitative measurement of the clinical symptom “coughing” in fattening pigs of herds endemically infected with M. hyopneumoniae and to examine the association between these findings and results from direct and indirect detection of the pathogen (PCR and ELISA). The direct detection of M. hyopneumoniae in BALF and the coughing index, which describes the number of onsets of coughing per 100 pigs and minute in a compartment, were statistically significantly associated. Moreover, a significant association was observed between the coughing index and the detection of antibodies specific for M. hyopneumoniae. It was demonstrated that a coughing index ≥2.5% combined with a seroprevalence of M. hyopneumoniae ≥0.5 is a strong indicator of enzootic pneumonia. In contrast to this, enzootic pneumonia is very unlikely, when the coughing index is <2.5% and simultaneously seroprevalence is <0.5. The results of this study served as basis for allocating herds in different groups of the case-control-study, which was conducted in part three of this project.   In order to examine the influence of environmental factors, management and coinfections on the occurrence of enzootic pneumonia a case-control-study was performed. Overall, 112 pig herds located either in Lower-Saxony or in North-Rhine Westphalia were epidemiologically characterized utilizing a standardised questionnaire and were clinically examined. Moreover, seroprevalence of M. hyopneumoniae was assessed in each herd by testing serum samples from 20 randomly selected fattening pigs with a commercial ELISA. The sera were also tested for antibodies against swine influenza virus (SIV) H1N1 and H3N2, as well as porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). According to their coughing index in fattening pigs and their seroprevalence of M. hyopneumoniae, herds were allocated to the group ‘case’ (n=40; coughing index ≥2.5%; seroprevalence ≥0.5), ‘control I’ (n=25; coughing index <2.5%; seroprevalence <0.5) or ‘control II’ (coughing index <2.5%; seroprevalence ≥0.5). Herds showing a high coughing index but low prevalence to M. hyopneumoniae were excluded from further analysis, since any other respiratory disease than enzootic pneumonia is more likely. Univariate and multivariate regression analyses were applied to data from management, animals’ environment and laboratory testing for coinfections. In these analyses and in the final models the herd size was considered as a continuous risk factor. Beside known risk factors for enzootic pneumonia, like strict all-in/all-out policy, several additional factors were identified. An increase of piglets’ age at weaning increased the risk for enzootic pneumonia in fattening pigs of the same herd. Similar, the administration of a one-shot vaccine against M. hyopneumoniae within the first two weeks of piglets´ life enhanced the risk of following disease. To the best knowledge of the author, this is the first study reporting that high reproductive performance in the sow herd is associated with a lower risk of enzootic pneumonia in fattening pigs. In summary, efficient separation of production units and pigs of different age, adequate acclimations of purchased gilts and replacement boars, appropriate vaccination concepts and housing of small numbers of fattening pigs per pen in a well-ventilated environment are the most important prerequisites in order to reduce the transmission M. hyopneumoniae and the risk of outbreaks of enzootic pneumonia.

Mycoplasma hyopneumoniae ist der Erreger der Enzootischen Pneumonie (EP) und weltweit endemisch in Regionen mit intensiver Schweinehaltung verbreitet. Die Erkrankung verursacht erhebliche ökonomische Schäden und kann mit den derzeit üblichen Bekämpfungsmaßnahmen (Impfung, Antibiotika) nicht verhindert, sondern lediglich in ihrer Ausprägung reduziert werden. Die Enzootische Pneumonie gilt als Faktorenkrankheit, wobei besonders Defizite hinsichtlich Haltung und Management der Schweineherde als Risiken angesehen werden. Die Benennung und Bewertung  verschiedener Risikofaktoren erfolgte bislang anhand von Einzelbetrachtungen auf Basis älterer empirischer Untersuchungen kleiner Stichproben. Die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen ergibt aus tiefgreifenden Strukturänderungen in der Schweinehaltung (Herdengröße, räumliche Trennung von Produktionseinheiten, pig flow) die einen maßgeblichen Einfluss auf die Erregerausbreitung haben. Die Weiterentwicklung neuerer Methoden zum Nachweis von M. hyopneumoniae erlaubt zudem eine differenziertere Beschreibung der Ausbreitung der Infektion in Schweineherden. Insbesondere das mögliche Vorkommen unterschiedlich virulenter Erregerstämme (genotypische und phänotypische Erregervariation) wurde bis heute in Feldstudien nicht berücksichtigt. Die Bearbeitung dieser These hat zum Ziel, den Einfluss der Erregervariation, verschiedener Umgebungs- sowie Managementfaktoren und ausgewählter Koinfektionen erstmalig in einer Studie zu untersuchen und hinsichtlich ihrer Risiken für die Manifestation der Enzootischen Pneumonie zu bewerten.   Im ersten Teilprojekt, dessen Fokus auf der Charakterisierung verschiedener Stämme von M. hyopneumoniae lag, wurde zunächst eine Methode etabliert, die eine schnelle und einfache Artdiagnose porziner Mykoplasmen nach Anzucht in Kulturmedien ermöglicht. M. hyopneumoniae, M. flocculare, M. hyorhinis, M. hyosynoviae und M. hyopharyngis wurden dabei anhand der Größe ihrer PCR Produkte nach Amplifikation der intergenischen 16S-23S Sequenzregion differenziert. Nachfolgend wurden 52 M. hyopneumoniae Stämme aus Probenmaterial von 45 Schweinen kulturell isoliert, die aus 21 Herden mit resp. ohne Symptome respiratorischer Erkrankungen bei Mastschweinen stammten. In sieben Fällen konnte M. hyopneumoniae sowohl aus bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) als auch Lungengewebe derselben Schweine isoliert werden. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) und variable number of tandem repeats (VNTR) Analysen wurden verwendet, um den Genotyp der Stämme zu bestimmen. Anhand der Ergebnisse beider Methoden konnte übereinstimmend festgestellt werden, dass unterschiedliche Stämme von M. hyopneumoniae nicht nur in verschiedenen Herden, sondern auch innerhalb einer Herde vorkommen. An zwei Schweinen konnte die gleichzeitige Infektion mit mindestens zwei genotypisch unterschiedlichen Stämmen von M. hyopneumoniae nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieses Teilprojekts lassen die Schlussfolgerung zu, dass die angewandten molekularen Typisierungsverfahren zur Identifizierung potentieller Virulenzfaktoren von M. hyopneumoniae an Probenmaterial aus endemisch infizierten Schweinebeständen wenig zielführend sind, da eine mögliche Zirkulation verschiedener Stämme in endemisch infizierten Herden zu berücksichtigen ist.   Im zweiten Teilprojekt dieser These wurde der diagnostische Wert der Quantifizierung klinischer Symptome zur Feststellung von Enzootischer Pneumonie bei Mastschweinen untersucht. Ein chronischer, trockener Husten in dieser Altersgruppe wird zwar als typisches Symptom einer klinischen Erkrankung infolge M. hyopneumoniae Infektion angesehen, der diagnostische Wert der klinischen Untersuchung wurde im Vergleich zum Nachweis typischer Veränderungen am Lungengewebe bzw. dem direkten oder indirekten Erregernachweis aber als eher gering eingeschätzt. Ziel der eigenen Untersuchung war es, das Auftreten von chronischem, trockenen Husten in endemisch mit M. hyopneumoniae infizierten Herden bei Mastschweinen zu quantifizieren und zum direkten resp. indirekten Erregernachweis (PCR, ELISA) in Beziehung zu setzen. Der direkte Nachweis von M. hyopneumoniae an BALF und der Hustenindex, der die Anzahl von Hustenanfällen je 100 Schweine und Minute beschreibt, waren statistisch signifikant assoziiert. Auch zwischen dem Nachweis von Antikörpern gegen M. hyopneumoniae und dem Hustenindex konnte eine statistisch signifikante Assoziation festgestellt werden. Es konnte gezeigt werden, dass ein Hustenindex ≥2,5 % in Verbindung mit einer Seroprävalenz von M. hyopneumoniae ≥0,5 mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit als Indiz für eine Enzootische Pneumonie zu bewerten sind. Im Gegensatz dazu ist eine Enzootische Pneumonie bei Mastschweinen sehr unwahrscheinlich, wenn der Hustenindex <2,5 % ist und die Seroprävalenz <0,5 beträgt. Ergebnisse dieses Teilprojekts wurden als Grundlage für die Einteilung der Bestände in der Fall-Kontroll-Studie im dritten Teilprojekt dieser These verwendet.   Mit dem Ziel, den Einfluss von Management- und Umgebungsfaktoren sowie von Koinfektionen auf das Auftreten der Enzootischen Pneumonie zu untersuchen, wurde eine Fall-Kontroll-Studie durchgeführt. Insgesamt 112 Schweineherden aus Niedersachsen und Nordrhein-Westfalen wurden epidemiologisch mittels eines Fragebogens charakterisiert und klinisch untersucht. Darüber hinaus wurde die Seroprävalenz von M. hyopneumoniae bei Mastschweinen an jeweils 20 Blutproben mittels ELISA bestimmt. Diese Proben wurden außerdem auf Antikörper gegen das swine influenza virus (SIV) H1N1 und H3N2 sowie gegen das porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) untersucht. Die Herden wurden entsprechend ihres Hustenindexes bei Mastschweinen und der Seroprävalenz von M. hyopneumoniae den Gruppen „Fall“ (n=40; Hustenindex ≥2,5%; Seroprävalenz ≥0,5), „Kontrolle I“ (n=25; Hustenindex <2,5%; Seroprävalenz <0,5) oder „Kontrolle II“ (n=35; Hustenindex <2,5%; Seroprävalenz ≥0,5) zugeordnet. Bestände mit einem hohen Hustenindex und geringer Seroprävalenz von M. hyopneumoniae wurden von der weiteren Datenanalyse ausgeschlossen, weil andere Ursachen als Auslöser der Atemwegserkrankung wahrscheinlich sind. Für die Analyse der Daten zum Management, zur Tierumgebung und zu den relevanten Koinfektionen wurden sowohl univariate, wie auch multivariate Regressionsanalysen durchgeführt. Die Risikofaktoren für eine Ausbreitung von M. hyopneumoniae innerhalb von Herden sollten durch den Vergleich der Gruppen „Kontrolle II“ gegen „Kontrolle I“ untersucht werden. Im Gegensatz dazu wurde erwartet, dass durch den Vergleich der Gruppen „Fall“ gegen „Kontrolle II“ besonders solche Faktoren erkannt werden, die für die klinische Apperenz von Enzootischer Pneumonie verantwortlich sind. Im dritten Modell, „Fall“ gegen „Kontrolle I“, wurde geprüft, welche Risikofaktoren die Ausbreitung des Erregers innerhalb der Herden und den nachfolgenden Ausbruch der Erkrankung beeinflussen. In der abschließenden Modellbildung wurde die Herdengröße jeweils als stetiger Risikofaktor berücksichtigt. Neben einigen bereits beschriebenen Risikofaktoren, wie bspw. die mangelhafte Trennung von Alters- und Produktionsgruppen, konnten weitere Risikofaktoren identifiziert werden. Ein Anstieg des Alters der Ferkel zum Zeitpunkt des Absetzens war mit einem erhöhten Risiko für Enzootische Pneumonie bei Mastschweinen verbunden und auch die Impfung von Saugferkeln innerhalb der ersten zwei Lebenswochen mit einer one-shot Vakzine gegen M. hyopneumoniae ging  mit einem erhöhten Risiko für eine Erkrankung einher. Die Beobachtung, dass Herden mit hoher Reproduktionsleistung der Sauen eine geringere Wahrscheinlichkeit für eine Enzootische Pneumonie bei Mastschweinen hatten, wurde in dieser Studie erstmalig beschrieben. Zusammenfassend konnte festgestellt werden, dass die effiziente Trennung von Alters- und Produktionsgruppen, eine adäquate Eingliederung zugekaufter Jungsauen und -eber, ein passendes Impfkonzept und die Aufzucht weniger Mastschweine pro Bucht in einer gut klimatisierten Umgebung  das Risiko für die Ausbreitung von M. hyopneumoniae und den Ausbruch der Enzootischen Pneumonie reduzieren.

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Nathues, Heiko: Influence of Mycoplasma hyopneumoniae strain variation, environmental factors and co-infections on Enzootic Pneumonia in pigs. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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