Dnd1

Humane Keimzelltumoren (GCT) kommen vom Kleinkind zum Erwachsenen in allen Altersgruppen vor und werden häufig in einem frühen Lebensabschnitt diagnostiziert. Teratokarzinome, eine Form von GCT, weisen die Besonderheit auf, Gewebe aller drei Keimblätter zu bilden und undifferenzierte Embryonale Karzinomzellen (ECC) zu enthalten. Pluripotente ECC entstehen durch neoplastische Transformation aus unipotenten Primordialen Keimzellen (PGC) bzw Gonozyten. Weitere Reproduktionsstörungen, wie z.B Infertilität, wurden bereits mit GCT der Hoden in Verbindung gebracht. Aus noch unbekannten Gründen nimmt die Inzidenz von männlichen GCT und Infertilität zu, wodurch die Identifizierung der krankheitsauslösenden Mechanismen zunehmend an Bedeutung gewinnt. Um GCT und Infertilität zu ergründen, ist es erforderlich die Faktoren und genetischen Hintergründe zu identifizieren, welche für die Differenzierung von Keimzellen zu reifen Gameten oder De-Differenzierung zu pluripotenten Zellen verantwortlich sind. Die ter Mutation in dem WKY/Ztm Rattenstamm verursacht Infertilität sowie Keimzelltumoren von Ovar und Hoden. Genetik und Phänotyp der WKY/Ztm-ter Ratte wurden in dem ersten Teil dieser Dissertation untersucht. Die ter Mutation konnte anhand von Kopplungsanalysen, Feinkartierung und Sequenzanalysen von Kandidatengenen auf eine Punktmutation zurückgeführt werden, welche ein vorzeitiges Stopcodon in dem dead-end homolog 1 Gen (Dnd1) verursacht. Genotypisierungen zeigten, dass der genetische Defekt rezessiv vererbt wird mit kompletter Penetranz von Teratokarzinogenese und Infertilität in homozygoten ter Ratten beider Geschlechter, wobei keine Teratome in wildtypischen oder heterozygoten Tieren vorkommen. Dies unterscheidet sich stark von der codominanten Ter Mutation in dem Dnd1 Gen der 129/Sv Maus, welche Infertilität und Hodenteratome, jedoch niemals ovariale Teratome, zur Folge hat. Die Teratokarzinogenese legt nahe, dass es sich bei Dnd1 um ein Tumorsuppressorgen handelt. Die Tumorprogression in der Ratte war zudem geschlechtsspezifisch unterschiedlich. Im Durchschnitt entwickelten sich die Teratome früher in weiblichen Ratten als in männlichen. Die Tatsache, dass morphologisch nicht tumoröse Hoden von homozygoten ter Ratten kleiner und leichter waren, konnte anhand von histologischen und immunhistochemischen Nachweisverfahren mit fehlender Spermatogenese in Zusammenhang gebracht werden. Da außerdem die nicht-neoplastischen Follikel von homozygoten ter Weibchen frei von Oogonien waren, liegt der Schluss nahe, dass Dnd1 als Survivalfaktor die Erhaltung von Keimzellen in der Ratte sichert. Der Vorteil der Ter Ratte gegenüber der ter Maus als Tiermodell liegt darin, dass diese auch Studien an Ovarteratomen ermöglicht, sowie einen Vergleich zwischen den Geschlechtern erlaubt. Generell ist die WKY-Dnd1ter/Ztm Ratte als neues Tiermodell anzusehen, insbesondere für weitere Studien zur gonadalen Teratokarzinogenese und zur Identifikation von molekularen Mechanismen, die im Rahmen von Keimzelldifferenzierung und De-Differenzierung eine Rolle spielen. Von zentraler Bedeutung sind hierbei die Tumorvorläuferzellen, die PGCs, und das Erkennen von Faktoren, die die neoplastische Transformation der PGCs zu ECCs induzieren oder beschleunigen. Ungeachtet der Tatsache, dass sich das Entwicklungspotential von PGCs auf die Keimbahn beschränkt, sind ECC nicht die einzigen pluripotenten Zellen, die von PGC abstammen. Durch in vitro Kultur können unipotente PGC zu pluripotenten embryonalen Keimzellen (EGC) reprogrammiert werden. EGC von der WKY-Dnd1ter/Ztm Ratte können als innovativer Ansatz dienen, um in vitro Studien zur Rolle von Dnd1 in Keimzelldifferenzierung und Tumorigenese zu ermöglichen. Die erfolgreiche Kultur von EGCs aus der Keimleiste der WKY-Dnd1ter/Ztm Ratte wurde im zweiten Teil dieser Dissertation etabliert. Heterozygote ter/+ Ratten wurden verpaart und die PGCs von Embryonen an Tag 14.5 post coitum (d pc) wurden in Medium kultiviert, das Inhibitoren enthielt, welche eine Ausdifferenzierung verhindern (2i-LIF). Die generierten Zelllinien wurden genotypisiert. Bis auf eine Zelllinie stammten alle von Dnd1-defizienten Embryonen ab. Dnd1 hatte dagegen keinen Einfluss auf die Kultivierung von prä-migratorischen EGC aus einem früheren Embryonalstadium. Dies bedeutet, dass die Inaktivierung von Dnd1 die Immortalisierung von späten, nicht jedoch von frühen PGC in vitro beeinflusst hat. Somit hat der Verlust von Dnd1 in PGC an d14.5pc vermutlich bereits die Entwicklungsrichtung in der Gametendifferenzierung zu Teratokarzinomen geändert. Die EGC-Linien konnten in Kultur Ihren pluripotenten Status aufrechterhalten, was anhand der Expression von Pluripotenzmarkern und der Bildung von Teratomen in immundefizienten Mäusen gezeigt wurde. Keimbahngängige Chimäre konnten durch Injektion der Wildtyp Zelllinie in Blastozysten generiert werden. Somit wurde erstmalig Keimbahngängigkeit für eine Ratten EGC-Linie gezeigt. Zusammenfassend konnte durch diese Arbeit die Bedeutung von Dnd1 in der KeimzelIentwicklung der Ratte aufgezeigt sowie veranschaulicht werden, dass der Verlust die De-Differenzierung von Keimzellen zu pluripotenten Zellen in vivo und in vitro zur Folge hat. Eine weitere Errungenschaft ist die Etablierung der Kultur von Keimzellen aus der Keimleiste der Ratte. Sowohl der charakterisierte WKY-Dnd1ter/Ztm Rattenstamm als auch die etablierte Kultur von EGCs aus der Keimleiste schafften neue Möglichkeiten für die weitere Erforschung des Dnd1 Gens und der Mechanismen, die an der Keimzellentwicklung beteiligt sind.