Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Dnd1

Northrup, Emily

Human germ cell tumors (GCT) can be observed in all age groups, ranging from infancy to adulthood, and are frequently diagnosed at a young age. Teratocarcinomas are GCTs consisting of derivatives from all three germ layers and undifferentiated embryonic carcinoma cells (ECCs). A disruption during embryonic development transforms unipotent primordial germ cells (PGC)/gonocytes into pluripotent ECCs. Other reproductive problems including infertility have been associated with testicular GCTs. For unknown reasons the incidence of male GCTs and infertility are on the rise in humans, making it increasingly important to elucidate the mechanisms triggering the disease. The key to understanding GCTs and infertility lies in discerning the factors and genetics regulating germ cell differentiation to mature gametes or de-differentiation to pluripotent cells. The ter mutation in the WKY/Ztm rat strain causes infertility along with ovarian and testicular teratomas. Genetics and phenotype of the WKY/Ztm-ter rat were investigated in the first part of this thesis. Linkage analysis, fine mapping and sequencing of candidate genes traced the ter mutation of the rat to a point mutation introducing a premature stop codon in the dead-end homolog 1 gene (Dnd1). Genotyping revealed a recessive mode of inheritance with complete penetrance of teratocarcinogenesis and infertility in homozygous ter rats of both genders, and no teratomas in their wild type or heterozygous counterparts. This differs strongly from the co-dominant Ter mutation in the Dnd1 gene of the 129/Sv mouse, which induces testicular teratoma and infertility but never ovarian teratomas. Gonadal teratocarcinogenesis indicates that Dnd1 acts as a tumor suppressor gene in mouse and rat. Teratoma progression in the rat was gender dependant and on the average tumors developed earlier in females than males. Morphologically non-tumorous testes of homozygous ter rats were reduced in size and weight. Immunohistochemical along with histological stainings associated the gonadal malformation with the absence of spermatogenesis. Additionally, oocytes were lacking in non-neoplastic follicles of homozygous ter females, thereby showing that Dnd1 is required for survival of non-neoplastic rat germ cells. The advantage of the ter rat over the Ter mouse model is the ability of the former to allow studies on ovarian GCTs and enable comparative studies on GCT development between genders. In general, the WKY-Dnd1ter/Ztm rat is a novel animal model for further studies on gonadal teratocarcinogenesis and the molecular mechanisms involved in germ cell differentiation or de-differentiation. A special focus lies on the tumor precursor cells, the PGCs, and identifying the factors inducing or accelerating their neoplastic transformation to ECCs. Although the developmental potency of PGCs is restricted to the germ lineage, ECCs are not the only pluripotent cells derived from PGCs. Through in vitro culture, unipotent PGCs can be converted into pluripotent embryonic germ cells (EGCs). EGCs from the WKY-Dnd1ter/Ztm rat present an innovative approach allowing in vitro studies on Dnd1 in germ cell differentiation and tumorigenesis. The successful culture of EGCs from the genital ridge of the WKY-Dnd1ter/Ztm rat was established in the second part of this thesis. Heterozygous ter/+ rats were mated and the PGCs from embryos at day 14.5 post coitum (d pc) were cultivated in media containing inhibitors of differentiating pathways (2i-LIF). The generated cell lines were genotyped, and almost all were found to stem from Dnd1-deficient ter/ter embryos. EGCs were also cultured from early rat embryos at d10.5pc, however, no Dnd1-dependent effects were observed. Taken together, these facts demonstrate that the inactivation of Dnd1 facilitates the immortalization of late, but not of early, PGC in vitro. This reveals that the loss of Dnd1 has altered the fate of PGCs by d14.5pc, and the development resulting in teratocarcinomas instead of gametes has commenced. The EGC lines could be maintained in a pluripotent state as demonstrated by expression of pluripotency markers and teratoma formation in immunodeficient mice. Injection of the wild type cell line into blastocysts resulted in germline competent chimeras, making this the first time that germline competence could be shown for a rat EGC line. In conclusion, this thesis demonstrates the importance of Dnd1 in rat germ cell development, with its loss resulting in de-differentiation of germ cells to pluripotent cells in vivo and in vitro. A further achievement is establishing the culture of genital ridge-derived rat EGCs. Both, the characterized WKY-Dnd1ter/Ztm rat strain and the established culture of EGCs from the genital ridge, open new possibilities for research in conjunction with the Dnd1 gene and the mechanisms involved in germ cell development.

Humane Keimzelltumoren (GCT) kommen vom Kleinkind zum Erwachsenen in allen Altersgruppen vor und werden häufig in einem frühen Lebensabschnitt diagnostiziert. Teratokarzinome, eine Form von GCT, weisen die Besonderheit auf, Gewebe aller drei Keimblätter zu bilden und undifferenzierte Embryonale Karzinomzellen (ECC) zu enthalten. Pluripotente ECC entstehen durch neoplastische Transformation aus unipotenten Primordialen Keimzellen (PGC) bzw Gonozyten. Weitere Reproduktionsstörungen, wie z.B Infertilität, wurden bereits mit GCT der Hoden in Verbindung gebracht. Aus noch unbekannten Gründen nimmt die Inzidenz von männlichen GCT und Infertilität zu, wodurch die Identifizierung der krankheitsauslösenden Mechanismen zunehmend an Bedeutung gewinnt. Um GCT und Infertilität zu ergründen, ist es erforderlich die Faktoren und genetischen Hintergründe zu identifizieren, welche für die Differenzierung von Keimzellen zu reifen Gameten oder De-Differenzierung zu pluripotenten Zellen verantwortlich sind. Die ter Mutation in dem WKY/Ztm Rattenstamm verursacht Infertilität sowie Keimzelltumoren von Ovar und Hoden. Genetik und Phänotyp der WKY/Ztm-ter Ratte wurden in dem ersten Teil dieser Dissertation untersucht. Die ter Mutation konnte anhand von Kopplungsanalysen, Feinkartierung und Sequenzanalysen von Kandidatengenen auf eine Punktmutation zurückgeführt werden, welche ein vorzeitiges Stopcodon in dem dead-end homolog 1 Gen (Dnd1) verursacht. Genotypisierungen zeigten, dass der genetische Defekt rezessiv vererbt wird mit kompletter Penetranz von Teratokarzinogenese und Infertilität in homozygoten ter Ratten beider Geschlechter, wobei keine Teratome in wildtypischen oder heterozygoten Tieren vorkommen. Dies unterscheidet sich stark von der codominanten Ter Mutation in dem Dnd1 Gen der 129/Sv Maus, welche Infertilität und Hodenteratome, jedoch niemals ovariale Teratome, zur Folge hat. Die Teratokarzinogenese legt nahe, dass es sich bei Dnd1 um ein Tumorsuppressorgen handelt. Die Tumorprogression in der Ratte war zudem geschlechtsspezifisch unterschiedlich. Im Durchschnitt entwickelten sich die Teratome früher in weiblichen Ratten als in männlichen. Die Tatsache, dass morphologisch nicht tumoröse Hoden von homozygoten ter Ratten kleiner und leichter waren, konnte anhand von histologischen und immunhistochemischen Nachweisverfahren mit fehlender Spermatogenese in Zusammenhang gebracht werden. Da außerdem die nicht-neoplastischen Follikel von homozygoten ter Weibchen frei von Oogonien waren, liegt der Schluss nahe, dass Dnd1 als Survivalfaktor die Erhaltung von Keimzellen in der Ratte sichert. Der Vorteil der Ter Ratte gegenüber der ter Maus als Tiermodell liegt darin, dass diese auch Studien an Ovarteratomen ermöglicht, sowie einen Vergleich zwischen den Geschlechtern erlaubt. Generell ist die WKY-Dnd1ter/Ztm Ratte als neues Tiermodell anzusehen, insbesondere für weitere Studien zur gonadalen Teratokarzinogenese und zur Identifikation von molekularen Mechanismen, die im Rahmen von Keimzelldifferenzierung und De-Differenzierung eine Rolle spielen. Von zentraler Bedeutung sind hierbei die Tumorvorläuferzellen, die PGCs, und das Erkennen von Faktoren, die die neoplastische Transformation der PGCs zu ECCs induzieren oder beschleunigen. Ungeachtet der Tatsache, dass sich das Entwicklungspotential von PGCs auf die Keimbahn beschränkt, sind ECC nicht die einzigen pluripotenten Zellen, die von PGC abstammen. Durch in vitro Kultur können unipotente PGC zu pluripotenten embryonalen Keimzellen (EGC) reprogrammiert werden. EGC von der WKY-Dnd1ter/Ztm Ratte können als innovativer Ansatz dienen, um in vitro Studien zur Rolle von Dnd1 in Keimzelldifferenzierung und Tumorigenese zu ermöglichen. Die erfolgreiche Kultur von EGCs aus der Keimleiste der WKY-Dnd1ter/Ztm Ratte wurde im zweiten Teil dieser Dissertation etabliert. Heterozygote ter/+ Ratten wurden verpaart und die PGCs von Embryonen an Tag 14.5 post coitum (d pc) wurden in Medium kultiviert, das Inhibitoren enthielt, welche eine Ausdifferenzierung verhindern (2i-LIF). Die generierten Zelllinien wurden genotypisiert. Bis auf eine Zelllinie stammten alle von Dnd1-defizienten Embryonen ab. Dnd1 hatte dagegen keinen Einfluss auf die Kultivierung von prä-migratorischen EGC aus einem früheren Embryonalstadium. Dies bedeutet, dass die Inaktivierung von Dnd1 die Immortalisierung von späten, nicht jedoch von frühen PGC in vitro beeinflusst hat. Somit hat der Verlust von Dnd1 in PGC an d14.5pc vermutlich bereits die Entwicklungsrichtung in der Gametendifferenzierung zu Teratokarzinomen geändert. Die EGC-Linien konnten in Kultur Ihren pluripotenten Status aufrechterhalten, was anhand der Expression von Pluripotenzmarkern und der Bildung von Teratomen in immundefizienten Mäusen gezeigt wurde. Keimbahngängige Chimäre konnten durch Injektion der Wildtyp Zelllinie in Blastozysten generiert werden. Somit wurde erstmalig Keimbahngängigkeit für eine Ratten EGC-Linie gezeigt. Zusammenfassend konnte durch diese Arbeit die Bedeutung von Dnd1 in der KeimzelIentwicklung der Ratte aufgezeigt sowie veranschaulicht werden, dass der Verlust die De-Differenzierung von Keimzellen zu pluripotenten Zellen in vivo und in vitro zur Folge hat. Eine weitere Errungenschaft ist die Etablierung der Kultur von Keimzellen aus der Keimleiste der Ratte. Sowohl der charakterisierte WKY-Dnd1ter/Ztm Rattenstamm als auch die etablierte Kultur von EGCs aus der Keimleiste schafften neue Möglichkeiten für die weitere Erforschung des Dnd1 Gens und der Mechanismen, die an der Keimzellentwicklung beteiligt sind.

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Northrup, Emily: Dnd1. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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