Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Chondrogene Differenzierung mesenchymaler Knochenmarkstammzellen mittels bioaktiver Poly-å-caprolactone Scaffolds

Paul, Svenja

Injured hyaline cartilage is replaced by morphologically, metabolically and biomechanically incompetent replacement tissue. The consequences are chronic pain, lameness and limitations of capability. Previously established regenerative procedures are not capable to lead to adequate –ideally hyaline-like- and long-lasting replacement tissue. The object of this paper was the development of a scaffold for the defect coverage following a microfracture (MFX) and an attachment with subsequent chondrogenic differentiation of the mesenchymal stem cells, which are washed in by MFX and therefore supports the regeneration of hyaline cartilage. The development of a biomimetic PCL-Scaffold was successful. By modification of the elektrospinning variable flow rate and voltage it was possible to create nano- and microfibers. We had no influence on the adjustment and constancy of the fibrediameter, it was randomly. Though we state that the manufactured Scaffolds were biomimetic they were not able to recruit cells. This observation was also seen in the TGF-β1 containing Scaffolds, though they released TGF-β1 over a period of up to 170 h. Noticeable was that microfibrous Scaffolds initially released high TGF-β1 concentrations over a period of 70 h, whereas nanofibrous Scaffolds showed a rapid decrease of the TGF-β1 concentration within the first 10 h. The cell-seeding of the Scaffolds with MSCs was successful in all cases, though the hyaluronic acid contained in VSNHA and VSMHA showed a partially significant increase of the initial cell-seeding. The lowest cDNA-concentration was seen in the Scaffolds with continuous TGF-β1 supplementation (VSP), so it can be assumed that TGF-β1 has an inhibiting effect on the proliferation of the MSCs. That explains why Scaffolds containing both, TGF-β1 and hyaluronic acid, showed lower cDNA concentrations than Scaffolds only containing hyaluronic acid, but higher concentrations than VSP. TGF-β1 seemed furthermore to induce the Collagen Type I and Type II expression, which is shown in the high concentrations in TGF-β1 containing Scaffolds and VSP. Although the continuously supplementation of TGF-β1 had a partly significant Influence on the expression of both of these markers. In contrast the presence of hyaluronic acid seemed to have an inhibitory effect on the expression of Collagen Type I. The relative expression of Aggrecan was obviously not influenced by the pre- or absence of growthfactors (TGF-β1) or molecules of the hyaline matrix (hyaluronic acid). Rather it is bound to the ultrastructural composition of the scaffolds. So it was shown that nanofibers promote the expression of Aggrecan with increasing time of culture, whereas microfibers rather have an opposite effect. This observation was also found for the expression of Collagen type II. However the expression of osteogenic markers was demonstrated for all scaffolddesigns independent from fibrestrenght or pre- and absence of particular growthfactors. And the course is similar to the VSP-experiment, so that it can be concluded that a transient expression of osteogenic genproducts within the chondrogenic differentiation is found. Against this background of the present results we conclude that a nanofibrous Scaffold augmented with hyaluronic acid has a chondrogenic effect on MSCs and is inhibiting an osteogenic Differentiation. This is more surprising as we can assume that the release and therefore the concentration of hyaluronic acid within a few days significantly decreases and so already an initial dose of hyaluronic acid has an essential effect on the chondrogenic differentiation of the MSCs later on. The effect of TGF-β1 is more complex. It seems that the expression of Collagen Type II is dependent on a continuous TGF-β1 dose, whereas the expression of Collagen Type I decreases after an initial increase in a continuous as well as in a transient supplementation of TGF-β1. This means that already an initial release of TGF-β1 from the scaffolds promotes an induction along the chondrogenic Zellline, which is not sufficient over a period of time longer than 21 days. Theoretically the ideal scaffold should have a nanofibrous structure, which releases a high initial dose of hyaluronic acid and ensures a continuous concentration of TGF-β1. The latter would be possible e.g. with a combination of TGF-β1 containing microspheres.

Geschädigter hyaliner Knorpel wird durch ein morphologisch, metabolisch und biomechanisch inkompetentes Narbengewebe ersetzt. Die Folge sind chronische Schmerzen, Lahmheit und Einschränkungen der Leistungsfähigkeit. Bisher etablierte regenerative Verfahren sind nicht in der Lage zur Bildung von adäquatem -im Idealfall hyalinartigem- und langlebigem Ersatzgewebe zu führen. Ziel dieser Arbeit war es ein Scaffold zu entwickeln, das in vivo zur Defektabdeckung im Anschluss an eine Mikrofrakturierung (MFX) eingesetzt werden kann und eine Anhaftung mit anschließender chondrogenen Differenzierung der, durch die MFX eingeschwemmten, mesenchymalen Stammzellen (MSC) bewirkt und somit die Regeneration des hyalinen Knorpels unterstützt. Die Herstellung biomimetischer Scaffolds aus PCL war erfolgreich. Durch Modifikation der Elektrospinning Variablen Flussrate und Spannung konnten Fasern unterschiedlicher Stärke im Nano- bis Mikrometerbereich erzeugt werden. Auf die Anordnung der Fasern sowie Konstanz der Faserdurchmesser konnte kein Einfluss genommen werden; sie war zufällig. Auch wenn konstatiert werden kann, dass die hergestellten Scaffolds biomimetisch waren, so konnte keines der Scaffolds Zellen rekrutieren. Diese Beobachtung fand sich auch für TGF-β1-haltige Scaffolds, auch wenn diese TGF-β1 über einen Zeitraum von bis zu 170 h freisetzten. Auffällig war, dass mikrofibröse Scaffolds initial TGF-β1 in hohen Konzentrationen über einen Zeitraum von bis zu 70 h freisetzten, wohingegen für nanofibröse Scaffolds ein rascher Abfall der TGF-β1 Konzentration innerhalb der ersten 10 h nachgewiesen wurde. Die Besiedlung der Scaffolds mit MSCs war in allen Fällen erfolgreich, wobei die in VSNHA und VSMHA enthaltene Hyaluronsäure eine teils signifikante Steigerung der initialen Besiedlung erbrachte. Die niedrigsten cDNA Werte fanden sich in Scaffolds mit einer kontinuierlichen TGF-β1-Supplementierung (VSP), sodass davon ausgegangen werden muss, dass TGF-β1 einen hemmenden Effekt auf die Proliferationsrate der MSCs hat. So ist es auch erklärbar, warum Scaffolds, die sowohl TGF-β1 als auch Hyaluronsäure enthielten, niedrigere cDNA Werte als hyaluronsäurehaltige Scaffolds, aber höhere als VSP aufwiesen. TGF-β1 schien zudem die Expression von Kollagen Typ I und II zu bewirken, was sich in hohen Konzentrationen in TGF-β1-haltigen Scaffolds sowie VSP widerspiegelte. Dabei hatte die kontinuierliche Supplementierung von TGF-β1 einen teils signifikanten Einfluss auf die Expression dieser beiden Marker. Die Anwesenheit von Hyaluronsäure schien hingegen einen hemmenden Einfluss auf die Expression von Kollagen Typ I zu haben. Die relative Expression von Aggrecan wurde offensichtlich nicht durch die An- oder Abwesenheit von Wachstumsfaktoren (TGF-β1) oder Molekülen der hyalinen Matrix (Hyaluronsäure) beeinflusst. Sie unterlag vielmehr der ultrastrukturellen Beschaffenheit der Scaffolds. So konnte gezeigt werden, dass Nanofasern die Expression von Aggrecan mit zunehmender Dauer der Kultur begünstigen und Mikrofasern eher einen gegenteiligen Effekt haben. Diese Beobachtung fand sich auch für die Expression von Kollagen Typ II. Die Expression osteogener Marker konnte hingegen für alle Scaffolddesigns unabhängig von Faserstärke oder An- und Abwesenheit bestimmter Wachstumsfaktoren nachgewiesen werden. Und deren Verlauf ähnelte dem des VSP Versuchs, sodass gefolgert werden muss, dass eine passagere Expression osteogener Genprodukte im Rahmen der chondrogenen Differenzierung zu finden ist. Vor dem Hintergrund der vorliegenden Ergebnisse schlussfolgern wir, dass ein nanofibröses Scaffold augmentiert mit Hyaluronsäure einen chondrogenen Effekt auf MSCs ausübt und eine Differenzierung entlang der osteogenen Zelllinie hemmt. Dies ist umso erstaunlicher, als dass davon ausgegangen werden muss, dass die Freisetzung und folglich auch die Konzentration von Hyaluronsäure innerhalb weniger Tage deutlich absinkt. Demnach hat bereits eine initiale Dosis an Hyaluronsäure einen entscheidenden Effekt auf die spätere chondrogene Differenzierung der MSCs. Der Effekt von TGF-β1 ist komplexer. So scheint die Expression von Kollagen Typ II von einer kontinuierlichen TGF-β1 Dosis abhängig zu sein, wohingegen die Expression von Kollagen Typ I sowohl bei kontinuierlicher als auch passagerer Supplementierung von TGF-β1 nach einem initialen Anstieg wieder abfällt. Das bedeutet, dass bereits eine initiale Freisetzung von TGF-β1 aus den Scaffolds eine Induktion entlang der chondrogenen Zelllinie begünstig, dies jedoch über einen Zeitraum länger als 21 Tage nicht ausreichend ist. Theoretisch sollte demnach das ideale Scaffold eine nanofibröse Struktur aufweisen, welche eine initial hohe Dosis an Hyaluronsäure freisetzt und eine kontinuierliche Konzentration von TGF-β1 gewährleistet. Letzteres wäre z.B. durch eine Kombination mit TGF-β1-haltigen Microspheres möglich.

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Paul, Svenja: Chondrogene Differenzierung mesenchymaler Knochenmarkstammzellen mittels bioaktiver Poly-å-caprolactone Scaffolds. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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