Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

The role of monocytes in remyelination and repair processes in the CNS

Škuljec, Jelena

Due to the fragmentary knowledge about molecular mechanisms of spontaneous remyelination, up to now there is no proven approach that promotes the repair of MS lesions. In vitro and in vivo studies provide increasing evidence that mononuclear phagocytes are beneficial for remyelination. Moreover, in recent years extensive cortical demyelination in MS patients has been recognized and highlighted. The cuprizone murine model is a commonly used and well established toxic model of demyelination in the white and gray matter without disrupting the blood-brain barrier. The aim of this project was to investigate whether CCL2, CCL3, CCL5, and CXCL1 modulate the cytokine and growth factor production, NO synthesis, and phagocytosis in non-stimulated and lipopolysaccharide (LPS)-stimulated primary rat microglia in vitro. We showed that CCR1, CCR5, and CXCR2 were functionally expressed on microglia. All tested chemokines stimulated chemotaxis. CCL5 and CCL2 increased NO, while only CCL5 attenuated IL-10 as well as IGF-1 production in activated microglia. None of these chemokines influenced TNF-α production or phagocytic activity. Further goal was to investigate the time-dependent expression patterns of 11 MMPs and 4 tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) during de- and remyelination in the cuprizone model. At nine time points mRNA was extracted from the laser microdissected cortex and corpus callosum and analyzed using quantitative PCR. In comparison with age-matched controls, MMP-12 was significantly upregulated in both areas during de- and remyelination. Interestingly, only in the white matter MMP-3, -11 and -14 were upregulated during remyelination, while MMP-24 was significantly downregulated during both de- and remyelination. Moreover, different expression patterns of TIMP-3 and TIMP-4 were observed in the corpus callosum and cortex. In addition, in the same model we studied the expression of surface markers, cytokines and growth factors as well as the phagocytic activity of ex vivo isolated microglia. During demyelination we found an increase of microglial phagocytic activity, associated with an upregulation of phagocytic receptors, particularly TREM-2b. The expression of MHC II was only increased at the peak of demyelination but the costimulatory molecules showed no significant changes. Interestingly, the proinflammatory cytokine TNF-α was upregulated while the anti-inflammatory cytokines IL-10 and TGF-ß remained unchanged. The expression of growth factors IGF-1 and FGF-2 was increased during demyelination.  Based on these findings, we propose that CCL5 directly induces a pro-inflammatory phenotype of activated microglia. However, these changes were modest and should be considered as a fine-tuning of microglia. Furthermore, concerning the high expression of MMP-3 and MMP-12 during remyelination, we suggest that MMPs may also regulate CNS tissue repair. Differences in MMP and TIMP expression levels in the white and gray matter indicate different molecular mechanisms in these areas. Changes of microglial phenotypes during de- and remyelination suggest that debris clearance mediated via TREM-2b may play an important role in the regulation of these processes. Microglial phagocytosis as well as the production of TNF-α, IGF-1, and FGF-2 seem to be involved in promoting regeneration.

Die molekularen Mechanismen der spontanen Remyelinisierung sind nur lückenhaft bekannt und Ansätze, die zweifelsfrei Reparaturmechanismen in Multiple Sklerose (MS)-Läsionen begünstigen, liegen nicht vor. Zahlreiche in-vitro- und in-vivo-Studien belegen mittlerweile, dass mononukleäre Phagozyten für die Remyelinisierung entscheidend sind. Wir untersuchten daher zunächst unstimulierte und lipopolysaccharid-stimulierte Ratten-Mikrogliazellen hinsichtlich direkter in-vitro Effekte der Chemokine CCL2, CCL3, CCL5 und CXCL1 auf Veränderungen der Zytokinproduktion, der NO-Synthese, der Wachstumsfaktoren und der Phagozytose. Im Vorfeld konnten wir zeigen, dass die Mikrogliazellen die Chemokin-Rezeptoren CCR1, CCR5 und CXCR2 exprimieren und die verwendeten Chemokine eine Chemotaxis fördern. Letztendlich führen die Chemokine CCL5 und CCL2 zu einem Anstieg von NO wohingegen CCL5 zusätzlich die IL-10- und IGF-1-Produktion senkt. Keines der Chemokine hat einen Einfluss auf die TNFα-Produktion oder auf die Phagozytose. Um die Rolle der Mikrogliazelle während der De- und Remyelinisierung zu untersuchen, verwendeten wir das Cuprizone-Mausmodell, welches ein etabliertes toxisches Tiermodell der Demyelinisierung der weißen als auch der grauen Substanz darstellt, ohne die Blut-Hirn-Schranke zu beeinflussen. Anhand dieses Tiermodells untersuchten wir die Expression von 11 Matrix Metalloproteinasen (MMP) und vier ihrer Inhibitoren, die sogenannten „tissue inhibitors of metallopreinases“ (TIMP), zu neun unterschiedlichen Zeitpunkten. Die angefertigten Lasermikroschnitte des Kortex und des Balkens wurden mittels quantitativer PCR analysiert. Hierbei stellten wir fest, dass im Vergleich zu den altersentsprechenden Kontrollen MMP-12 in beiden Hirnarealen während der Re- und Demyelinisierung signifikant erhöht ist. MMP-3, MMP-11 und MMP-14 sind lediglich in der weißen Substanz und ausschließlich während der Remyelinisierung signifikant erhöht, wohingegen MMP-24 in beiden Phasen erniedrigt ist. Bei den Inhibitoren TIMP-3 und TIMP-4 beobachteten wir ferner ein unterschiedliches Expressionsmuster im Balken und im Kortex. In demselben Modell erfolgten zudem Untersuchungen der Expression von Oberflächenmarkern, Zytokinen, Wachstumsfaktoren und der Phagozytose an ex-vivo isolierten Mikrogliazellen. Wir konnten nachweisen, dass die Phagozytoseaktivität während der Demyelinisierung erhöht ist und mit einer Hochregulierung von Phagozytoserezeptoren, insbesondere TREM-2b, einhergeht. Die Expression des MHC-II-Moleküls ist lediglich zum Gipfel der Demyelinisierung erhöht und nicht mit einer Veränderung von kostimulatorischen Molekülen verbunden. Das pro-inflammatorische Zytokine TNF-α wird vermehrt produziert, wohingegen die anti-inflammatorischen Zytokine IL-10 und TGF-β unverändert bleiben. Die Wachstumsfaktoren IGF-1 und FGF-2 sind während der Demyelinisierung signifikant erhöht. Die vorliegenden Ergebnisse belegen einen direkten Einfluss von CCL5 auf Mikrogliazellen, welches bei diesen Zellen einen pro-inflammatorischen Phenotyp induziert. Diese Veränderungen sind allerdings minimal i.S. eines zellulären „fine tunings“. Die erhöhte Exprimierung von MMP-3 und MMP-12 während der Remyelinisierung lässt darauf zurück schließen, dass diese Proteine Reperaturvorgänge regulieren können. Die Unterschiede in den Proteinexpressionen in der grauen und weißen Substanz weisen ferner auf unterschiedliche molekulare Mechanismen hin. Die phänotypische Veränderung der Mikroglia impliziert, dass das Abräumen von Debris, vermittelt durch TREM-2b, als auch die direkte Phagozytose eine bedeutende Rolle während der De- und Remyelinisierungsvorgänge spielen. Die Produktion von TNF-α, IGF-1 und FGF-2 scheinen zudem die Regeneration zu fördern.

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Škuljec, Jelena: The role of monocytes in remyelination and repair processes in the CNS. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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