Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Effekte spezifischer Milch- und Eidotterkomponenten bei der Konservierung von Hengstsperma

Volker, Stefanie

The aim of this study was to examine the effects of milk (naturally and synthetically produced caseins and caseinmicelles) and egg yolk components (Low Density Lipoproteins) on sperm quality of cooled stored and frozen-thawed stallion semen with regard to progressive motility, sperm velocity, plasmamembrane integrity, acrosomal status. 84 ejaculates of ten warmblood stallions (four to 22 years old) were collected at the State Stud of Lower Saxony in Celle during October/November 2009 and July 2010 and analyzed in a split-sample-model. The first experiment was subdivided into five experiments. Different milk components in a saline basic solution were tested for their effects on stallion sperm quality during cooled storage over 96 hours at +5°C. Two different caseins (Casein-Natrium-Emulac (Minitüb, Tiefenbach) and casein sodium salt from bovine milk, (SIGMA, Steinheim), ß-lactoglobuline, whey powder, skimmed-milk-powder and UHT-milk were used as milk components. Progressive motility, velocity average path and velocity curved line were estimated by computervideomicrographic sperm analysis (CASA-system Sperm Vision TM SC). Plasmamembrane integrity and acrosomal status were analysed by flowcytometry (Cell Lab QuantaTM SC Beckmann Coulter, Krefeld). In experiment 1 extender containing casein showed a significantly higher percentage of progressivly motile sperm than milk-based extender. Addition of ß-lactoglobuline to the casein-based extender did not show an additive effect on sperm quality with regard to motility, plasmamembrane integrity and acrosomal status. ß-lactoglobuline in an extender without casein lead to significantly decreased sperm quality during cooled storage. Extender C, which was developed and modified during this study showed comparable results to the commercially available extender INRA 96® (IMV Technologies, L`Aigle, France) with regard to progressive motility, plasmamembrane integrity and acrosomal status. The synthetically produced extender Equi ProTM (modified) (Minitüb, Tiefenbach, Germany) with extender C composition showed similar results. In conclusion, the developed extender Equi ProTM(modified) is a comparable alternative to INRA 96® and should be tested in insemination experiments to analyze the effect on pregnancy rates after fresh semen insemination. The addition of whey- and skimmed milk-powder (“Gloria”, Nestle) did not show any improvement of sperm quality during cooled storage of stallion sperm. In experiment 2, 5% egg yolk from different preparation processes and 2.5% glycerol were added to extender Equi ProTM (modified). Isolated low density lipoproteins (LDL) (MANJUNATH et al. 2002) , clarified eggyolk (ultracentrifugation) , eggyolk with Equex STM paste (Nova Chemical Sales Inc, Scituate) and commercialized, liquid and pasteurised eggyolk (Tetra Pak, Wiesenhof, Germany) were used as differently processed egg yolk components in the freezing extenders. Although the addition of eggyolk and Equex STM paste lead to a significantly higher percentage of progressively motile sperm than the addition of separated low density lipoproteins, a significant increase in plasmamembrane integrity after addition of LDL-extender revealed a positive effect of low density lipoproteins on sperm quality three hours after thawing. The optimal concentration of LDL in frozen semen extenders should be identified in further studies to improve the quality of frozen-thawed stallion semen.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Effekte natürlicher und synthetisch hergestellter Caseine und Caseinmicellen sowie Eidotterkomponenten (Low Density Lipoproteine) auf Hengstsperma hinsichtlich progressiver Motilität, verschiedener Geschwindigkeitsparameter, Plasmamembranintegrität, akrosomalem Status und Haltbarkeit zu untersuchen. Es standen insgesamt 84 Ejakulate von zehn Warmbluthengsten (vier bis 22 Jahre) des Niedersächsischen Landgestütes Celle für die im split-sample Modell durchgeführten Versuche im Zeitraum Oktober/November 2009 und Juli 2010 zur Verfügung. Der erste Versuch gliederte sich in fünf Versuchsabschnitte. Es wurden unterschiedliche Milchkomponenten einer salinen Grundlösung hinzugefügt und auf ihre Konservierungseigenschaften von Hengstsperma geprüft. Als Milchkomponenten fungierten zwei unterschiedliche Caseine (Casein-Natrium-Emulac, Fa. Minitüb und Casein sodium salt from bovine milk, Fa. SIGMA, Steinheim), ß-Lactoglobulin, Molkepulver, Magermilchpulver und UHT-Milch. Die progressive Motilität sowie die mittlere und kurvolineare Bahngeschwindigkeit wurden mittels Computervideomikrographie (CASA-System Sperm VisionTM, Fa. Minitüb, Tiefenbach) ermittelt. Die Überprüfung der Plasmamembranintegrität und des akrosomalen Status erfolgte via Durchflusszytometrie (Cell Lab QuantaTM SC, Fa. Beckmann Coulter, Krefeld). Die Verdünner mit Caseinzusatz wiesen signifikant höhere Vorwärtsmotilitäten als die Verdünner mit Milchzusatz auf. ß-Lactoglobulin zeigte zusätzlich zum Casein keinen additiven Effekt auf die progressive Motilität, die Plasmamembranintegrität und den akrosomalen Status der Spermien. Wurde ß-Lactoglobulin ohne Caseinzusatz verwendet, so verschlechterten sich die Werte signifikant. Weiterhin zeigte der während dieser Studie entwickelte und modifizierte Verdünner C vergleichbare Ergebnisse bezüglich Vorwärtsmotilität, Plasmamembranintegrität und akrosomalem Status mit dem Verdünner INRA 96® (IMV Technologies, L`Aigle, Frankreich). Der synthetisch hergestellte Verdünner Equi ProTM (modifiziert) (Fa. Minitüb, Tiefenbach, Deutschland), der die gleiche Zusammensetzung wie Verdünner C hat, konnte ähnliche Ergebnisse aufweisen. Der während dieser Arbeit entwickelte Verdünner Equi ProTM (modifiziert) ist somit eine vergleichbare Alternative zu INRA 96®. Der Zusatz von Molke- und Milchpulver („Gloria“, Fa. Nestlé) konnte keine Verbesserung der Haltbarkeit von Hengstsperma verursachen. Im zweiten Versuch wurde 5% Eidotter aus unterschiedlichen Herstellungsverfahren und 2,5% Glycerol dem Verdünner Equi ProTM (modifiziert) hinzugefügt. Bei den Aufbereitungsformen des Eidotters handelte es sich um nach dem Verfahren von MANJUNATH et al. (2002) aus Eidotter isolierte Low Density Proteine, durch Ultrazentrifugation klarifizierten Eidotter, Eidotter versetzt mit Equex STM Paste (Fa. Nova Chemical Sales Inc, Scituate) und kommerziell erhältlichen, flüssigen, pasteurisierten Eidotter (Tetra Pak, Fa. Wiesenhof, Wietzen). Hinsichtlich der Motilität unterschieden sich die Eidotteraufbereitungen wenig voneinander. Nur der Verdünner mit Eidotter+Equex STM Paste zeigte eine signifikant höhere progressive Motilität als der Verdünner mit LDLs. Die Plasmamembranintegrität der mit dem LDL-Verdünner tiefgefrorenen Samenzellen war drei Stunden nach dem Auftauen am höchsten und unterschied sich signifikant von den mit den Vergleichsverdünnern tiefgefrorenen Spermien, nicht aber von den mit Equi ProTM+Eidotter klarifiziert tiefgefrorenen Samenzellen. Um eine Verbesserung der Qualität des kryokonservierten Samens zu erreichen, ist es sicherlich sinnvoll, in weiterführenden Studien eine optimale Konzentration der LDLs im Tiefgefriersamenverdünner für Hengstsperma herauszufinden. Außerdem sollte der optimierte modifizierte Verdünner Equi ProTM in Besamungsversuchen getestet werden, um eine Aussage über die Fertilität treffen zu können.

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Volker, Stefanie: Effekte spezifischer Milch- und Eidotterkomponenten bei der Konservierung von Hengstsperma. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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