Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Role of basic fibroblast growth factor (FGF-2) during development of mesencephalic dopaminergic neurons of substantia nigra in mice

Baron, Olga

Progredient loss of mesencephalic dopaminergic neurons (mDA) in the substantia nigra pars compacta (SNpc) is the main cause for characteristic symptoms in Parkinson’s disease. Insight in the regulation of the SNpc development may benefit to the understanding of disease pathophysiology and improvement of therapeutic approaches. Previous studies revealed in addition to a protecting function of FGF-2 in mature mDA neurons, a regulatory role of FGF-2 for proper development of substantia nigra pars compacta (SNpc). The increased numbers of tyrosine hydroxylase immunoreactive (THir) neurons in SNpc of adult FGF-2 deficient mice correlated with decreased numbers in FGF-2 overexpressing mice. However, with regard to the mitogenic and neuroprotective function of FGF-2 on dopaminergic precursors and adult neurons, respectively, the opposed outcome was anticipated. To elucidate the physiological function of FGF-2 in the nigrostriatal development, the present study concentrated on embryonic (E14.5), newborn (P0), and juvenile (P28) FGF-2 deficient mice. Stereological analysis on the content of TH-ir cells, in the SNpc of FGF-2 depleted mice could delineate the onset of the phenotype between E14.5 and P0. Additionally, the separate examination of the SNpc and ventral tegmental area (VTA) in juvenile mice (P28) showed a specific increase in number of TH-ir cells in SNpc. Examination of the mDA marker gene expression by quantitative RT-PCR and in situ hybridization revealed an unchanged patterning of the embryonic VM of FGF-2 deficient. Moreover, a comprehensive analysis of transcript levels of the complete FGF system revealed no compensation of FGF-2 loss by upregulation of any other FGF family member. To unravel the underlying mechanism, immunohistochemical analysis of proliferation rates in E14.5 animals and of apoptosis rates in P0 animals was performed. However, increase of proliferating Lmx1a-ir mDA progenitors in the subventricular zone of FGF-2 deficient embryonic VM indicated an imbalance in FGF signaling resulting in altered cell cycle progression of neuronal progenitors and enhanced differentiation of mDA neurons. In SNpc of newborn FGF-2 deficient mice a decrease of apoptotic cells negative for cleaved caspase-3 was detected. Additionally, enhanced mDA fiber outgrowth in VM and forebrain explant co-cultures of FGF-2 deficient mice was observed compared to heterogenous or wild type cultures. The decreased apoptosis and enhanced fiber outgrowth suggest an incoherent wiring control during innervation of the forebrain structures under FGF-2 deficiency. Altogether, presumably both physiological alterations determine the phenotype in the ventral mesencephalon of the adult FGF-2 depleted mice: longer or enhanced neurogenic divisions of progenitors may cause an increased generation of mDA neurons, while altered wiring control during the maturation may lead to reduced ontogenic death of mDA neurons. Investigation of molecular signaling mechanisms revealed that activation of intracellular signaling cascades, like ERK1/2, Akt and also Wnt/β-catenin signaling, were maintained in absence of FGF-2 in the VM of FGF-2 deficient E14.5 embryos. On the other hand, nuclear FGFR1 was found to be increased in the nucleus of FGF-2 deficient mice. Additionally, a novel INFS / Nurr1 interactive mechanism for gene activation during neuronal development has been identified, as shown by co-localization and co-imunoprecipitation of Nurr1 and FGFR-1 and underlined by functional assays of collaborators. Exemplary, this study revealed a novel INFS / Nurr1 interactive mechanism for gene activation during neuronal development, which may offer a new therapeutic target to increase production of mDA neurons for restorative approaches in Parkinson’s disease.

Parkinson’sche Erkrankung ist durch den Untergang der dopaminergen Neurone in der Substantia nigra pars compacta (SNpc) charakterisiert. Die Entschlüsselung physiologischer und molekularer Mechanismen während der Entwicklung der SNpc würde zum besseren Verständnis der Ätiologie der Parkinson’schen Erkrankung sowie zur weiteren Entwicklung Zell-basierter therapeutischer Ansätze beitragen. Frühere Studien haben gezeigt, dass FGF-2 möglicherweise eine Rolle bei der Entwicklung mesenzephaler dopaminerger Neurone spielt. So hat die Untersuchung adulter FGF-2-defizienter Mausmutanten ergeben, dass im Vergleich zu den Wildtyp-Tieren in der SNpc dieser Mutanten signifikant mehr Tyrosinhydroxylase (TH)-positive Neurone vorhanden sind, welches als Marker für die dopaminegen Neurone dient, da es limitierend bei der Dopaminsynthese ist. Entsprechend zu diesem Befund wurden in den FGF-2 überexpremierenden Mutanten signifikant weniger dopaminerge Neurone vorgefunden. Da FGF-2 als mitogener und neurotropher Faktor für dopaminerge Neurone bekannt ist, wurde ein genau entgegengesetzter Phänotyp erwartet. Diese Befunde wurden mit einer möglichen Überkompensation des FGF-2-Verlustetes durch andere Faktoren diskutiert. Um die Rolle des FGF-2 bei der Entwicklung der dopaminergen Neurone eingehender zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit embryonale (E14,5), neugeborene (P0) und juvenile (P28) FGF-2 defiziente Mausmutanten untersucht. Die stereologische Erhebung der TH-positiven Zellen hat ergeben, dass der Phänotyp mit erhöhter TH-positiver Zellzahl sich zwischen E14,5 und P0 entwickelt. Ferner wurde in den juvenilen Stadien festgestellt, dass der Phänotyp SNpc-spezifisch ist. Die quantitative RT-PCR zeigte keine Unterscheide bezüglich der dopaminergen Markergene bei der Entwicklung der FGF-2 defizienten Mäuse und Wildtyp-Tiere, was auf eine normale Spezifikation der dopaminergen Domäne in der frühen embryonalen Entwicklung der FGF-2-defizienten Mäuse hindeutet. Auch die mRNA-Level anderer Mitglieder der FGF-Familie wurden in den FGF-2 defizienten Mutanten unverändert vorgefunden, was eher eine Kompensation auf Proteinebene beziehungsweise durch andere Faktoren vermuten lässt. Zwei physiologische Prozesse wurden mit Hilfe immunzytochemischer Analysen verändert vorgefunden, die beide zusammen die Entwicklung des beobachteten Phänotypes begründen könnten. Einerseits wurde eine erhöhte Proliferation Lmx1a-positiver dopaminerger Vorläufer in der subventrikulären Zone jedoch nicht in der ventrikulären Zone der FGF-2-defizienten Embryonen vorgefunden. Dies deutet auf ein Ungleichgewicht im FGF-Signalweg hin, wobei mehr Vorläufer zu dopaminergen Neuronen differenzieren. Der andere verändert vorgefundene entwicklungsphysiologische Prozess ist der verringerte ontogenetische Zelltod in neugeborenen FGF-2-Mutanten, der mit verändertem dopaminergem Faserwachstum zu telenzephalen Zielstrukturen in explantierten Co-Kulturen aus ventralem Mittelhirn sowie Vorderhirn korreliert werden konnte. Wobei die längeren Fasern der reinen FGF-defizienten Co-Kulturen sowie breiteren Trakte der heterogenen Co-Kulturen im Vergleich zu kürzeren in einem schmaleren Trakt gelegenen Fasern der reinen Wildtyp-Co-Kulturen auf eine reduzierte Kontrolle der adäquaten Verdrahtung der nigrostriatalen dopaminergen Fasern hindeuten. Die biochemische Analyse der ERK1/2, Akt und Wnt/β-catenin Signalwege im embryonalen VM zeigte keine Unterschiede in ihrer Aktivierung in FGF-2 defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Tieren. Allerdings wurde in embryonalen Stadien eine Akkumulation des FGF-Rezeptors-1 in nukleären Extrakten aus ventralem Mittelhirn der FGF-2-defizienten Mäuse vorgefunden, was auf eine verstärkte Aktivierung des Intergrativen Nukleären FGFR-1 Signalweges (INFS) hindeutet. INFS wurde mit neuronaler Differenzierung und Induktion der TH-expression in Verbindung gebracht. Zusätzlich, wurde ein neuer interaktiver Mechanismus zwischen INFS und Nurr1, einem zentralen integrativen Transkriptionsfaktor in der dopaminergen Entwicklung, identifiziert und charakterisiert, der bei der Entwicklung zukünftiger regenerativer Strategien für Parkinson-Therapie eine Rolle spielen könnte.

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Baron, Olga: Role of basic fibroblast growth factor (FGF-2) during development of mesencephalic dopaminergic neurons of substantia nigra in mice. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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