Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Thrombozytenfunktionsmessung im Schafblut: Optimierung der Aggregationsmessung im Multiplate Analyser und Einfluss der Probenlagerung

Baumgarten, Andrea

The examination of haemostasis in sheep is primarily important considering their role in various experimental models including general surgical, trauma surgical, cardiovascular surgical and sepsis or other shock studies. Platelet aggregometry is one of the main in vitro standard techniques for the evaluation of platelet functions.   The intention of the first part of the present study was to examine whether the new whole blood impedance aggregometer (Multiplate ™ 5.0 Analyzer, Dynabyte) is a valuable tool to examine platelet aggregation in sheep, to optimise agonist concentrations and to determine reference values for ovine blood. In the first experiment, different concentrations of several agonists (adenoindiphosphat [ADP], collagen, thrombinrezeptor-activating peptid [TRAP-6], ristocetin and arachidonic acid) were added to hirudin-anticoagulated blood of six (TRAP, ristocetin, arachidonic acid) or ten (ADP and collagen) healthy sheep to optimize the agonist concentrations. The following concentrations have been used: - ADP: 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 10 and 20 µmol/l; - collagen: 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 10 and 20 µg/ml; - TRAP-6: 32 and 160 µmol/l; - ristocetin: 0.2 and 1 mg/ml; - arachidonic acid: 0.25, 0.5, 1 and 2 mmol/l. TRAP-6, ristocetin, and arachidonic acid are unsuitable agonists for induction of whole blood impedance aggregation in ovine platelets (median measurement signals < 5 % of the median measurement signals achieved with ADP or collagen). Based on the results of the examinations using ADP and collagen as agonists, further measurements were performed on 30 sheep with selected agonist concentrations (ADP: 3, 4, 5 and 10 µmol/l; collagen: 3, 4 and 5 µg/ml). The lowest agonist concentration leading to the maximum aggregation measurement signal, minimal inter-individual variation and the highest precision based on the internal measurements in duplicate were used as selection criteria. However, 20 % of the measurements with ADP had to be repeated. Reference values based on the total number of 40 healthy sheep revealed a wide variation of measurement values. In ten healthy sheep (n=10), hirudin-anticoagulated blood and in comparison citrate-anticoagulated blood (with and without the addition of calcium chloride) were measured using different concentrations of ADP and collagen. Hirudin-anticoagulated blood generated significantly higher measurement signals. Knowledge of changes of the haemostatic function in stored ovine blood are important with respect to diagnostic and therapeutic aspects as well the use of ovine blood in ex vivo models, e.g. for tests of thrombogenicity. The aim of the second part of this study was to investigate how storage of whole ovine blood for three days influences platelet function and whether the storage temperature affects the results. Whole blood of ten healthy sheep was stored in citrate-phosphate-dextrose-adenosine (CPDA)-1-stabilized transfer bag system on a wobbler, five blood bags at room temperature (20-25°C) and five blood bags at refrigerator temperature (4°C). Immediately after blood withdrawal and after 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24, 48 and 72 hours of storage the platelets were counted automatically as well as visually. The number and size of platelet aggregates were counted visually. Additionally, the platelet function was examinated by impedance aggregometry (using 5 and 10 µmol/l ADP as well as 5 µg/ml collagen) as well as by turbidimetric aggregometry (using 10 and 20 µmol/l ADP as well as 5 and 10 µg/ml collagen). Furthermore, a resonance thrombogram (RTG) was prepared and different parameters of the plasmatic coagulation were measured: the prothrombin time, activated partial thromboplastin time, thrombin time, and the fibrinogen concentration using the Jacobssen method. On each day before taking the blood for the storage experiments citrate-anticoagulated blood was taken from the equal sheep and the same measurements were carried out to get comparison values. After storage for 24 hours at 4°C the platelet count decreased significantly, whereas it remained stable at room temperature. A low percentage of platelet aggregates was present immediately after the withdrawl of the blood sample into the transfer bag. After five hours of storage at 4°C approx. 50–60 % of the platelets were within aggregates, whereas only approx. 20–30 % of the platelets formed aggregates in blood which was stored at 20–25°C for up to 72 hours. In addition, platelet aggregates were larger, i.e. consisted of more platelets, when storage was performed at 4 °C. A decrease of aggregability measured with impedance aggregometry was only seen in blood stored at 4 oC (after 4 hours with collagen, after 24 hours with ADP). Maximum turbidimetric aggregation values of the blood stored at 4°C decreased significantly after 5 to 24 hours, dependent on agonist and agonist concentration. In contrast, maximum turbidimetric aggregation did not decrease before a storage time of 24 hours, if blood bags were stored at room temperature. There was no significant change of any of the investigated parameters of the plasmatic coagulation when compared to initial values. A significant shortening of RTG-r at individual times in blood which was stored at room temperature and a prolongation of RTG-p at the end of the observation period in blood stored at 4°C were the only obvious storage-induced changes of the RTG. In conclusion, based on the results of the first part of this study the investigated method of whole blood impedance aggregometry is well appropriate for the examination of ovine platelets in hirudin-anticoagulated blood using the agonists ADP and collagen in the optimal concentrations (ADP: 4–5 µmol/l; collagen : 4–5 µg/ml). In the second part of the study, the most relevant storage-induced change was the functional loss and high percentage of platelets within aggregates in ovine blood stored at refrigerator temperature. This fact has to be taken into account when blood transfusion in sheep is performed, because blood bags are stored at refrigerator temperature to maintain quality of red blood cells. However, when the short-term preservation of haemostasis and platelet function is the primary aim, e.g. for ex vivo experiments, room temperature is the preferred storage temperature providing a relatively stable material for one working day.

Die Untersuchung der Hämostase von Schafen ist vornehmlich vor dem Hintergrund ihrer Rolle als Studienmodelltier, z.B. für allgemeine, cardiovaskuläre und traumatische Chirurgiestudien sowie Sepsis- und Schock-Modelle, von großer Wichtigkeit. Thrombozyten-Aggregometrie ist eine der wichtigsten in vitro-Standard-Techniken zur Untersuchung der Thrombozytenfunktion. Das Ziel des ersten Teils der vorliegenden Studie war es, herauszufinden, ob das neue Vollblut-Impedanz-Aggregometer (Multiplate ™ 5.0 Analyzer, Dynabite) eine geeignete Methode zur Untersuchung der Thrombozytenaggregation von Schafblut darstellt, optimale Agonistenkonzentrationen zu ermitteln und entsprechende Referenzwerte für Blut von Schafen zu evaluieren. Im ersten Schritt der Untersuchungen wurden unterschiedliche Agonisten (Adenoindiphosphat [ADP], Kollagen, Thrombinrezeptor-aktivierendes Peptid [TRAP-6], Ristocetin und Arachidonsäure) in verschiedenen Konzentrationen bei Hirudin-antikoaguliertem Blut von sechs (TRAP, Ristocetin und Arachidonsäure) bzw. zehn (ADP und Kollagen) gesunden Schafen eingesetzt, um die optimalen Agonistenkonzentrationen zu evaluieren. Es kamen die folgenden Konzentrationen zum Einsatz: - ADP: 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 10 und 20 µmol/l; - Kollagen: 0.5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 10 und 20 µg/ml; - TRAP-6: 32 und 160 µmol/l; - Ristocetin: 0,2 und 1 mg/ml und - Arachidonsäure: 0,25, 0,5, 1 und 2 mmol/l. Dabei stellten sich TRAP-6, Ristocetin und Arachidonsäure als ungeeignete Agonisten für die Vollblut-Impedanz-Aggregometrie von Schafblut heraus (Messsignale im Median <5 % der der nach Induktion mit ADP oder Kollagen erreichten Medianwerte). Basierend auf den Ergebnissen der mit ADP und Kollagen durchgeführten Messungen wurde das Blut weiterer 30 Schafe mit ausgewählten Konzentrationen dieser beiden Agonisten fortgesetzt (ADP: 3, 4, 5 und 10 µmol/l; Kollagen: 3, 4 und 5 µg/ml). Selektionskriterien für Agonistenkonzentrationen waren maximales Messsignal bei möglichst geringer Agonistenkonzentration, minimale interindividuelle Varianz und höchste Präzision beruhend auf der internen Doppelmessung. Allerdings mussten 20 % der Messungen, bei denen ADP als Agonist eingesetzt wurde, wiederholt werden. Referenzbereiche basierend auf insgesamt 40 gesunden Schafen zeigten eine deutliche Streuung der Messwerte. Bei zehn Schafen (n=10) wurde neben Hirudin-antikoaguliertem Blut zum Vergleich auch Blut mit Citrat als Antikoagulans (mit und ohne Rekalzifizierung) unter Einsatz verschiedener Konzentrationen von ADP und Kollagen untersucht. Hierbei zeigten sich deutlich höhere Messsignale im Hirudin-antikoagulierten Blut. Kenntnisse zu Veränderungen der Hämostase in gelagertem Schafblut sind sowohl vor dem Hintergrund der Nutzung zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken als auch zum Einsatz in ex vivo-Modellen, z.B. Thrombogenizitätsuntersuchungen, von Bedeutung. Daher wurde im zweiten Teil der Studie untersucht, welchen Einfluss eine dreitägige Lagerung von Schafvollblut auf die Thrombozytenfunktion hat und ob die Lagerungstemperatur dabei von Bedeutung ist. Vollblut von zehn gesunden Schafen wurde in Citrat-Phosphat-Dextrose-Adenosin (CPDA)-1-stabilisierten Transfusionsbeuteln auf einem Taumelschüttler gelagert, fünf Konserven bei Raumtemperatur (20–25 °C) und fünf bei Kühlschranktemperatur (4 °C). Jeweils unmittelbar nach Blutnahme und nach einer Lagerungsdauer von 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24, 48 und 72 Stunden wurde die Thrombozytenzahl automatisch und visuell ermittelt sowie die Anzahl und Größe von Thrombozytenaggregaten visuell erfasst. Außerdem wurde die Thrombozytenfunktion untersucht mittels Vollblut-Impedanz-Aggregometrie (mit Hilfe von 5 und 10 µmol/l ADP sowie 5 µg/ml Kollagen) sowie mittels der turbidimetrischen Methode nach Born (unter Einsatz von 10 und 20 µmol/l ADP sowie 5 und 10 µg/ml Kollagen). Des Weiteren wurde ein Resonanzthrombogramm (RTG) geschrieben und die plasmatische Gerinnung durch Messung von Prothrombinzeit, aktivierter partieller Thromboplastinzeit, Thrombinzeit und Fibrinogenkonzentration mit der Methode nach Jacobssen überprüft. Jeweils am Tag vor der Blutentnahme in den Transferbeutel wurde von jedem Tier eine Citrat-antikoagulierte Blutprobe gewonnen und hiermit alle genannten Untersuchungen zur Erlangung von Vergleichswerten durchgeführt. Die Thrombozytenzahl fiel nach 24 Stunden Lagerung bei 4 oC signifikant ab, wohingegen die Thrombozytenzahl während der Lagerung bei Raumtemperatur im Untersuchungszeitraum stabil blieb. Bereits direkt nach der Blutentnahme ließ sich in den Blutbeuteln ein niedriger Prozentsatz von in Aggregaten vorliegenden Thrombozyten finden. Schon nach fünf Stunden Lagerung bei Kühlschranktemperatur war dieser Anteil auf ca. 50–60 % angestiegen, wohingegen während der gesamten Lagerungsdauer von 72 Stunden bei Raumtemperatur höchstens  20–30 % der Thrombozyten Aggregate bildeten. Des Weiteren bestanden die Aggregate im bei 4 oC gelagerten Blut aus einer höheren Anzahl Thrombozyten. Eine Abnahme der mittels Impedanzaggregometrie gemessenen Aggregationsfähigkeit konnte lediglich in bei 4 °C gelagertem Blut (nach 4 Stunden mit Kollagen, nach 24 Stunden mit ADP) festgestellt werden. Auch bei den Messungen mit der turbidimetrischen Methode verminderten sich die maximalen Aggregationswerte in bei 4 °C gelagerten Proben agonistenabhängig nach 5–24 Stunden signifikant. Wurde das Blut hingegen bei Raumtemperatur gelagert, nahmen die maximalen Aggregationswerte frühestens nach 24 Lagerungsstunden ab. Bei keiner Lagerungstemperatur war bei den Parametern der plasmatischen Gerinnung eine signifikante Veränderung im Vergleich zu den Initialwerten festzustellen. Abgesehen von einer signifikanten RTG-r-Verkürzung zu einzelnen Zeitpunkten während der Lagerung bei Raumtemperatur und einer RTG-p-Verlängerung zum Ende der Lagerungsdauer bei 4 °C zeigte das RTG keine lagerungsbedingten Veränderungen. Zusammenfassend lässt sich basierend auf den Untersuchungsergebnissen des ersten Teils sagen, dass die untersuchte Methode der Vollblut-Impedanz-Aggregometrie mit den Agonisten ADP und Kollagen in den optimalen Konzentrationen (ADP: 4–5 µmol/l; Kollagen: 4–5 µg/ml) geeignet ist, um Schafthrombozyten im Hirudin-antikoagulierten Blut zu untersuchen. Im zweiten Teil zeigte sich als wichtigste lagerungsbedingte Veränderung der Funktionsverlust und der hohe Anteil an zu Aggregaten zusammengelagerter Thrombozyten in bei 4 °C gelagertem Schafblut. Dies muss bei der Bluttransfusion bei Schafen beachtet werden, da Blutkonserven mit Rücksicht auf den Erhalt der Funktionalität von Erythrozyten bei Kühlschranktemperatur gelagert werden. Ist jedoch die kurzzeitige Erhaltung der Hämostase und der Thrombozytenfunktion das primäre Ziel bei der Lagerung, z.B. für ex vivo-Experimente, sollte Raumtemperatur die bevorzugte Lagerungstemperatur sein, um ein relativ stabiles  Arbeitsmaterial für einen Arbeitstag zu haben.

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Baumgarten, Andrea: Thrombozytenfunktionsmessung im Schafblut: Optimierung der Aggregationsmessung im Multiplate Analyser und Einfluss der Probenlagerung. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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