Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Systematische Parameteranalyse der Einfriergeschwindigkeit unter Verwendung des Controlled-Rate-[my]-Freezer

Bednarczyk, Wawrzyniec

Semen samples were obtained from Hanoverian breeding stallions of National Stud Celle. After collection the semen was extended (INRA 82) and centrifuged (600xg, 10 min). Then it was diluted with INRA82 freezing extender (2.5% egg yolk, 2.5% glycerol) until 100 x 106 spermatozoa/ ml. Following cooling for 2 hours until +5°C the semen was frozen using the Controlled-Rate-μ-Freezer device. In the first part of the study 12 different freezing rates were tested simultaneously i.e. 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 and 60°C/ min. All samples up to the moment of thawing (200μl tubes: 37°C, 120 sec.) and examination were stored in liquid nitrogen. Motility and plasma membrane integrity were tested. All samples were examined two times: immediately after thawing and 3 hours after thawing. In experiment 1 results showed that freezing rates 5 and 60°C/ min decreased sperm motility and viability significantly. Furthermore, semen of significantly higher quality was obtained at freezing rates between 15 and 45°C/ min. In experiment 2 semen was frozen using 4 cryoprotectants: (2.5% glycerol Gly, 1.8% methylformamide MF, a mixture of 1% Gly and 1.2% MF, and 2.2% dimethylsulfoxide DMSO) and four freezing rates (15, 30, 45 and 60°C/ min). Semen was prepared as described for the first experiment. Osmolarity for all extenders was set at 690 mOsm. Stallion semen frozen in extender with MF and a mixture of Gly and MF as cryoprotectant gave similar results when compared  with semen frozen with Gly, thus MF could be a suitable alternative to Gly in cryopreservation protocols for  stallion semen. Semen frozen with DMSO showed significantly decreased sperm quality postthawing when compared to Gly, MF, and MF plus Gly. Freezing rates (15, 30, 45 and 60°C/ min) did not indicate notable differences. In experiment 3 three different extenders for semen freezing were compared (INRA82, INRA96 and Botu-Crio®). Semen was centrifuged (600xg, 10 min) using EquiPRO® extender. Samples were frozen at 15 and 45°C/ min. Semen analysis was conducted two times: immediately after thawing (0,5ml straws: 37°C, 30 sec. when frozen in INRA82 and INRA96, 60 sec. in Botu-Crio®) and 3 hours after thawing. Postthaw semen quality was superior for semen frozen with INRA82 and INRA96 when compared to samples extended with Botu-Crio®. Freezing rate had no statistically significant effect.

Ziel der vorliegenden Arbeit war eine Untersuchung des Einflusses der Einfriergeschwindigkeit und verschiedener Kryoprotektiva auf die Samenqualität nach dem Auftauen. Für die Untersuchung standen hannoversche Hengste des Niedersächsischen Landgestüts in Celle zur Verfügung. Das Sperma wurde nach der Samenabnahme in INRA 82 verdünnt  und dann bei 600 x g für 10 min.  zentrifugiert. Danach erfolgte die Endverdünnung mit INRA82-Gefriersamenverdünner (2,5%  Eidotter, 2,5% Glycerol) bis zu einer Konzentration von 100 x 106 Spermien/ml. Die Proben wurden über zwei Stunden bis 5 °C heruntergekühlt und dann mithilfe des Controlled-Rate-µ-Freezer eingefroren. Im ersten Versuchsteil wurden 12 verschiedene Einfrierraten simultan getestet: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 und 60 °C/ min. Alle Proben wurden bis zum Auftauen und zur Untersuchung in flüssigem Stickstoff gelagert. Danach erfolgten die Untersuchung der Motilitäts- und Membranvitalitätsparameter der Spermien und die statistische Auswertung der Ergebnisse. Alle Proben wurden zweimal untersucht: gleich nach dem Auftauen sowie nach drei Stunden Lagerzeit. Die Auftauresultate (Auftauen der 200μl PCR-Röhrchen: 37°C, 120 Sek.) des ersten Versuchsteils zeigten deutlich, dass Einfrierraten von 5 bzw. 60 °C/ min signifikant schlechter sind als andere Geschwindigkeiten. Außerdem ist eine bessere Qualität des Samens, eingefroren bei Raten zwischen 15 und 45°C/ min, deutlich zu sehen. Im zweitem Versuchsteil wurde Samen mit vier Kryoprotektiva (2,5 % Glycerol Gly, 1,8 % Methylformamid MF, Mischung: 1 % Gly/ 1,2% MF und 2,2% Dimethylsulfoxid DMSO) und mit vier Einfrierraten (15, 30, 45 und 60 °C/ min) eingefroren. Die Vorbereitung des Samens bis zur Endverdünnung und die Untersuchung erfolgten nach dem gleichen Prinzip wie im ersten Versuchsteil. Alle Kryoprotektiva zeigten in angepasster Konzentration in INRA82 die gleiche Osmolalität von 690 mOsm. Mit MF und der Mischung aus Gly und MF eingefrorener Samen zeigte ähnliche Auftauergebnisse wie Samen, der mit Glycerol kryokonserviert wurde. Methylformamid könnte deswegen eine gute Alternative zu Glycerol bei der Kryokonservierung von Hengstsperma sein. Samen, welcher mit DMSO eingefroren wurde, zeigt signifikant schlechtere Ergebnisse als Samen, bei dem die anderen Kryoprotektiva verwendet wurden. Der Vergleich zwischen den benutzten Einfriergeschwindigkeiten im zweiten Versuchsteil ergab keine signifikanten Unterschiede. Im dritten Versuchsteil wurden drei Einfrierverdünner (INRA82, INRA96 und Botu-Crio®) verglichen. Als Zentrifugationsverdünner wurde für alle Proben EquiPRO® benutzt. Alle Proben wurden mit zwei Einfrierraten eingefroren: 15 und 45°C/ min. Die Untersuchung des Samens erfolgte zweimal: sofort und drei Stunden nach dem Auftauen. Samen, welcher mittels der Einfrierverfahren INRA82 und INRA96 eingefroren wurde, zeigte in diesem Versuch bessere Auftauergebnisse (Auftauen der 0,5ml Pailleten: 37°C, 30 Sek. beim Einfrieren in INRA82 und INRA96, 60 Sek. in Botu-Crio®) als jener, bei dem das Botu-Crio®  -Verfahren angewendet wurde. Der in INRA82 und INRA 96 eingefrorenen Samen haben ähnliche Auftauresultate erreicht. Der Vergleich zwischen den Einfrierraten ergab keine signifikanten Unterschiede.

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Bednarczyk, Wawrzyniec: Systematische Parameteranalyse der Einfriergeschwindigkeit unter Verwendung des Controlled-Rate-[my]-Freezer. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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