Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Transcriptome analysis of preadult hypobiotic and non-hypobiotic L5 stages as well as in vitro studies on the sexual maturation of preadult larvae of the bovine lungworm Dictyocaulus viviparus

Laabs, Eva-Maria Wiebke

Survival of the bovine lungworm Dictyocaulus viviparus, which belongs to one of the most important parasites in cattle, is guaranteed by arrested development under harsh environmental conditions, referred to as hypobiosis. The first part of this thesis therefore used a subtractive hybridization approach to compare the transcription profiles of hypobiotic as well as non-hypobiotic preadult larvae (L5hyp and L5, respectively). 75 L5hyp-enriched and 58 L5-enriched representative ESTs (rESTs) were identified. The following sequence identity search disclosed that 28 L5hyp-rESTs and 11 L5-rESTs were homologue to known transcripts and 47 L5hyp- and 47 L5-rESTs had no homologies with published sequences, hence possibly representing parasitic or even Dictyocaulus specific genes. Differential transcripts were predicted to be involved in nucleic acid synthesis, DNA binding, metabolic pathways as well as signal transduction. Following the transcription analysis, parasite´s development in the normal direction was further investigated in order to understand sexual development, differentiation and maturation of D. viviparus and its sex-specific genes. Since a study on the aforementioned aspects over a period of 45 days was not possible in the host, an in vitro cultivation technique was established first. Therefore, the second part of the thesis dealt with the establishment of an in vitro cultivation method for L5, the examination of growth and morphological as well as molecular changes during sexual maturation. The best cultivation results in consideration of growth, motility and survival period were accomplished with RPMI-1640 medium supplemented with L-glutamine, 50% fetal bovine serum, amphotericin B (0.25 mg/ml), penicillin (10,000 Units/ml) and streptomycin (10 mg/ml) at 5% atmospheric CO2 and 39°C incubation temperature. During the cultivation procedure individuals grew averagely from 4.64 mm to 9.88 mm independent of the individual number per setup. Considering sexual development, cultivated females started to lay eggs and the testes of males were filled with spermatozoa. Hence, adult female and male lungworms developed. Nevertheless, copulation could not be detected and no larvae hatched from laid eggs. Additionally, development was examined by gene transcription analysis of the major sperm protein (msp) and vitellogenin (vit), which represent male and female sexual development. The male msp transcription reached its maximum 5 days of cultivation (20 days post infection), followed by a gradual decrease. Female vit transcription showed the highest transcription 15 days of cultivation (30 days post infection). Nevertheless, the transcription rate of female adults directly from the host is not reached. In conclusion, the results of the presented thesis provide on the one hand a first basis for further characterization as well as analysis of genes, which drive normal and arrested (hypobiotic) parasite development and on the other hand describe for the first time a reliable cultivation method of preadult larvae to adults. Furthermore, it supplies information about male as well as female sexual maturation, which might be extrapolated to the parasite’sdevelopment in the natural host.

Das Überleben des Rinderlungenwurms Dictyocaulus viviparus, der zu den bedeutendsten Parasiten der Rinder gehört, wird durch eine Entwicklungshemmung sichergestellt, die durch niedrige Temperaturen ausgelöst wird. Diese Entwicklungshemmung wird auch als Hypobiose bezeichnet. Der erste Teil der These verwendete einen Subtractive Hybridization Ansatz, um die Transkriptionsprofile der hypobiotischen sowie der nicht hypobiotischen präadulten Larven (L5hyp bzw. L5) zu vergleichen. Im Zuge dessen wurden 75 in der L5hyp Population angereicherte und 58 in der L5 Population angereicherte repräsentative ESTs (rESTs) identifiziert. Die nachfolgende Suche nach Sequenzidentitäten ergab, dass 28 L5hyprESTs und 11 L5-rESTs Homologien mit bekannten Sequenzen aufwiesen, wohingegen 47 L5hyp- und 47 L5-rESTs keinerlei Homologien mit bisher publizierten Ergebnissen aufwiesen. Letztere könnten potentiell parasitische oder sogar Dictyocaulus spezifische Gene repräsentieren. Den differentiellen Transkripten wurde eine Beteiligung in der Nukleinsäuresynthese, bei der DNA Bindung, im Metabolismus und in der Signaltransduktion vorhergesagt. Nach der Transcriptomanalyse wurde die Entwicklung des Parasiten in die normale Richtung weiter untersucht, um die sexuelle Entwicklung, Differenzierung und Maturation von D. viviparus und dessen geschlechtsspezifischen Genen zu verstehen. Da eine Studie der zuvor genannten Aspekte über eine Zeitspanne von 45 Tagen im Wirt nicht möglich war, wurde zunächst eine in vitro Kultivierungsmethode entwickelt. Daher behandelt der zweite Teil der These die Entwicklung einer in vitro Kultivierungsmethode für L5, die Untersuchung von Wachstum und morphologischen wie auch molekularen Veränderungen während der sexuellen Maturation. Das beste Kultivierungsergebnis, berücksichtigt man Wachstum, Beweglichkeit und Überlebensdauer, wurde mit RPMI-1640 Medium mit zugesetztem L-Glutamin, 50% fetalem Kälberserum, Amphoterizin B (0,25 mg/ml), Penicillin (10.000 Units/ml) und Streptomycin (10 mg/ml) inkubiert bei 5% CO2 und 39°C erzielt. Während des Kultivierungsprozesses zeigte sich eine deutliche Größenzunahme von durchschnittlich 4,64 mm auf 9,88 mm unabhängig von der Anzahl der kultivierten Individuen pro Ansatz. Im Bezug auf die sexuelle Entwicklung begannen weibliche Individuen Eier zu legen, wohingegen die Hoden männlicher Individuen mit Spermatozoen angefüllt waren. Daher kann gesagt werden, dass sich adulte Männchen und Weibchen entwickelt haben. Trotzdem war es nicht möglich eine Kopulation zu beobachten und aus den Eiern schlüpften keine Larven. Zusätzlich wurde die Entwicklung auch durch die Analyse der Gentranskription des major sperm protein (msp) und des vitellogenin (vit) untersucht, Gene die die männliche und die weibliche sexuelle Entwicklung repräsentieren. Die männliche msp Transkription erreichte dabei ihr Maximum 5 Tage nach Kultivierungsbeginn (20 Tage nach Infektion), gefolgt von einer Schrittweisen Abnahme. Die weibliche vit Transkription wies die höchste Transkription 15 Tage nach Kultivierungsbeginn (30 Tage nach Infektion) auf. Dennoch erreichte die Transkriptionsrate nie die Werte von adulten, direkt aus der Lunge eines Kalbes isolierten Weibchen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Ergebnisse der vorliegenden These einerseits eine erste Basis für die weitere Charakterisierung und Analyse von Genen sind, die normale aber auch gehemmte (hypobiotische) Parasitenentwicklung steuern und andererseits eine Beschreibung der ersten zuverlässigen Kultivierung von präadulten Larven zu adulten Würmern liefern. Zudem werden weitere wertvolle Informationen über männliche und weibliche sexuelle Entwicklung bekannt, die eventuell auf die Parasitenentwicklung im Wirt extrapoliert werden können.

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Laabs, Eva-Maria Wiebke: Transcriptome analysis of preadult hypobiotic and non-hypobiotic L5 stages as well as in vitro studies on the sexual maturation of preadult larvae of the bovine lungworm Dictyocaulus viviparus. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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