Epitope mapping of the structural protein Erns of Classical swine fever virus

Meyer, Denise

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Epitope mapping of the structural protein Erns of Classical swine fever virus

German
English

Das Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV) wird dem Genus Pestivirus innerhalb der Familie Flaviviridae zugeordnet. Es verursacht eine der wirtschaftlich bedeutendsten Infektionserkrankungen des Haus- und Wildschweins weltweit, die in der Europäischen Union anzeigepflichtig ist. Im Verlauf einer Infektion mit KSPV werden Antikörper gegen das Strukturprotein Erns gebildet. Bisher ist hinsichtlich der antigenen Struktur des Proteins wenig bekannt. Einzelne lineare Epitope konnten mit Hilfe von Peptidbibliotheken näher charakterisiert werden. Versuche mit trunkierten Erns Proteinen ließen auf drei sich überlappende antigene Domänen (AR1 = Ernsaa 65 - 145, AR2 = Ernsaa 84 - 160; AR3 = Ernsaa 109 - 220) schließen. Zusätzlich wird angenommen, dass die meisten Epitope diskontinuierlich vorliegen. Um die bereits bestehenden Erkenntnisse über die antigene Struktur des Erns Proteins zu erweitern, ist es von großer Bedeutung eine Methode zu entwickeln, welche die Proteinstruktur nur in einem sehr geringen Maße beeinflusst. In der vorliegenden Arbeit wurden chimäre Erns Konstrukte hergestellt, wobei definierte Bereiche des KSPV Erns (Stamm Alfort/187) gegen die entsprechenden Regionen des Bovinen Virusdiarrhoe Virus (BVDV) ausgetauscht wurden. Entsprechend des Reaktivitätsmusters der monoklonalen Antikörper (mAk) mit den chimären Proteinen konnte eine antigene Domäne zwischen Aminosäure 55 und 110 für das Erns Protein des KSPV Stammes Alfort/187 identifiziert werden. Jedoch reagierten die mAk nicht mit einem trunkierten Erns Protein, welches ausschließlich auf der antigenen Domäne basierte. Dies wiederum bestätigte die Annahme von diskontinuierlichen Epitopen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass der heterogene C-Terminus des Erns Proteins keinen Einfluss auf die Antikörperbindung hat. Auf der Basis von Proteinsequenzanalysen und der Kreuzreaktivität der mAk mit unterschiedlichen Pestiviren, wurden Erns Mutanten hergestellt. Mit Hilfe dieser Mutanten konnte gezeigt werden, dass Variationen in der Proteinsequenz an den Positionen 102 und 107 innerhalb der pestiviralen Erns Proteine einen großen Einfluss auf die Antikörperbindung haben. Interessanterweise ist die Aminosäure an Position 102 bei einigen Pestiviren Bestandteil einer potentiellen N-linked Glykosylierungsstelle. Es ist nicht auszuschließen, dass diese Glykosylierungsstelle die Antikörperbindung an das Erns Protein des BVDV Stammes NADL beeinflusst. In dieser Studie konnten neue Erkenntnisse bezüglich der antigenen Struktur des Erns Proteins gewonnen werden. Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse können zukünftig verbesserte diagnostische Tests entwickelt werden, die in Kombination mit Markerimpfstoffen eine Differenzierung von geimpften und infizierten Tieren gewährleisten.

Classical swine fever virus (CSFV) belongs to the genus Pestivirus of the family Flaviviridae. It is the causative agent of a highly contagious, notifiable disease of domestic pigs and wild boar with serious economic consequences worldwide. The enveloped glycoprotein Erns is one of the targets of the host's immune response during viral infection. In respect to the antigenic structure not much is known about the Erns protein. Recent epitope mapping approaches using small peptides have revealed the existence of linear epitopes. Furthermore, deletion analysis of the Erns protein led to the identification of three overlapping antigenic regions (AR1 = Ernsaa 65 ‑ 145, AR2 = Ernsaa 84 - 160; AR3 = Ernsaa 109 - 220) which might include discontinuous epitopes. However, it was shown that most of the epitopes of the Erns protein seem to be discontinuous. To supplement the existing knowledge about the epitopes, an improved technique was required which preserved the three‑dimensional protein structure. In this study, chimeric Erns constructs were generated in which different parts of the CSFV Erns (strain Alfort/187) were replaced by the corresponding regions of another pestivirus, namely Bovine viral diarrhea virus (BVDV-1 strain NADL). According to the reactivity of the monoclonal antibodies (mAbs) with the chimeric proteins one antigenic domain on the Erns protein of the CSFV strain Alfort/187 was identified which is located between amino acids 55 to 110. After cellular expression of the truncated protein (Erns aa 55 - 110) the mAbs showed no reactivity indicating that the epitopes are discontinuous. The C-terminus of the Erns protein is the most heterogeneous part of the protein, but has no significant influence on the antibody binding. Based on protein sequence analysis of the pestiviral Erns and the cross reactivity of the mAbs with different pestiviral strains, substitution mutants were generated. It was possible to show that the natural variations within the amino acid sequence at position 102 and 107 have a crucial influence on the antibody binding. The amino acid at position 102 is part of a potential N-linked glycosylation site in some pestiviral strains. It can not be excluded, that this glycosylation site may have an influence on the antibody binding to the BVDV Erns (strain NADL). This study has provided new insights into the antigenic structure of the Erns protein. On this basis, the development of advanced diagnostic immunoassays is possible. In combination with marker vaccines Erns-specific immunoassays might have an important application to ensure the differentiation between vaccinated and infected animals.