Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

In vitro and ex ovo studies of biocompatibility of magnesium-silver alloys and their antimicrobial effects on bovine bacterial species

Nomier, Yousra Ahmed Reyad

The aim of this study is to investigate the ability of MgAg1% alloys to inhibit bacterial growth during the dry off period. For this purpose, primary mammary epithelial cells and primary mammary fibroblasts were successfully isolated, cultured and verified by phase contrast microscopy and immunofluorescence. In addition, three main points (biocompatibility, degradation properties and antibacterial effects) were addressed in order to achieve the objective. In doing so, not only the the antibacterial effects of MgAg1% alloys could be evaluated but some light was shed on the impact of the alloys on the tissue response, too. In the in vitro models of differentiated primary mammary cells (epithelium and fibroblasts), murine fibroblasts and murine macrophages (primary as well as raw cell line) acceptable biocompatibility without a marked increase in mediators of inflammation was shown. However, a slight influence on the cell viability of the different concentrations of AgNO3 solution was observed at high concentrations. While different volumes of the degradation medium of MgAg1% sticks did not show an influence on cell viability, using different assays such as (MTS assay, neutral red assay and Bradford assay). On the other hand, there was no effect on the activity of cytosolic and mitochondrial marker enzymes (PK and SDH, respectively). In the ex vivo study on isolated perfused udders MgAg1% sticks showed the ability to degrade within 5-6 hours of incubation in mammary teats, which was confirmed with the weight loss and histological examinations. Furthermore, MgAg1% sticks degraded during 21 days of incubation in dry off period secretion (60% of the initial weight) which represents a favourable base in pursuit of this approach. But the question remains whether this degradation kinetic will suffice for the whole dry off period and whether it is suitable for the treatment of acute and peracute mastitis. The isolated perfused udder goes beyond the in vitro models regarding the in vivo situation. Its use enabled the tissue reaction to be tested in a dynamic environment, which together with the in vitro models gives a more complete overview of the impact of MgAg1% sticks in an udder without the utilization of animal experiments. The antibacterial effect of different concentrations of AgNO3 solution and different volumes of degradation medium of MgAg1% sticks was successfully evaluated. The bouillion dilution test showed antibacterial activity of the degrading supernatants (MgAg1% sticks incubated in NaCl) on the growth of E. coli and S. aureus. Furthermore, the cultivation of the bacterial colonies (E. coli and S. aureus) showed 5-fold reduction in the number of bacterial colonies, when incubated with the degrading supernatants (MgAg1% sticks incubated in NaCl) compared to the untreated control bacteria. The BRT-MRL screening test showed an inhibition of Geobacillus stearothermophilus bacteria at AgNO3 concentraions equal to 0.01 mmol/l or above, and at concentration equal to 3 ml up to 1 ml of degradation medium of MgAg1% sticks.  Regarding that the amount of silver ions in 3 ml volume up to 1 ml of volume of degradation medium was equal to 0.02-1 mmol/l which already showed antibacterial effect. In conclusion an ex vivo and in vitro system for the testing of MgAg1% alloys was successfully established. The results were satisfying concerning biocompatibility, degradation process and antibacterial effects. However, other questions are not answered yet, for instance, if the sticks should be used in parallel with or instead of antibiotics and for which types of mastitis they should be used. Although our present study showed a good biocompatibility, a good degradation process and high antibacterial effects, it may be of interest trying to achieve higher concentrations in further investigations.

Das Ziel dieser Studie ist es, die Eignung von MgAg1%-Legierungen zu untersuchen, bakterielles Wachstum während der Trockenstehperiode zu hemmen. Zu diesem Zweck ist es gelungen, primäre Euterepithelzellen und primäre Euterfibroblasten zu isolieren, in Kultur zu nehmen und mittels Phasenkontrast-Mikroskopie und Immunfluoreszenz zu verifizieren. Darüber hinaus wurden drei Hauptpunkte (Biokompatibilität, Degradationseigenschaften und antibakterielle Effekte) angegangen, um das gesetzte Ziel zu erreichen. Auf diesem Wege konnte nicht nur die antibakterielle Wirkung von MgAg1% Legierungen bewertet werden, sondern es wurde auch etwas Aufschluss gegeben über den Einfluss der Legierungen auf die Gewebereaktion. In den In-vitro-Modellen der differenzierten primären Euterzellen (Epithel und Fibroblasten), der murinen Fibroblasten und murinen Makrophagen (primäre sowie raw-Zelllinie) zeigte sich eine annehmbare Biokompatibilität ohne deutlichen Anstieg der Entzündungsmediatoren. Dennoch wurde ein leichter Einfluss der unterschiedlichen Konzentrationen von AgNO3 und der unterschiedlichen Volumina an Degradationsmedium der MgAg1%-Stäbchen auf die Zellvitalität (MTS-Assay, Neutralrot-Assay und Bradford-Assay) gesehen. Andererseits gab es keinen Effekt auf die Aktivität der cytosolischen und mitochondrialen Markerenzyme (PK bzw. SDH). In der Ex-vivo-Studie an isoliert perfundierten Eutern, zeigte sich die Degradationsfähigkeit der MgAg1%-Stäbchen während der 5-6 Stunden dauernden Inkubation in den Zitzen, welche anhand der Gewichtsabnahme und histologischen Untersuchungen bestätigt wurde. Darüber hinaus degradierten MgAg1%-Stäbchen während einer 21-tägigen Inkubation in Trockenstehsekret (60% des ursprünglichen Gewichts) was eine erfreuliche Basis für die Weiterverfolgung dieses Ansatzes ist. Es bleibt jedoch die Frage, ob dieser Degradationsverlauf für die gesamte Trockenstehzeit ausreichend ist und ob er sich zur Behandlung von akuten und perakuten Mastitiden eignet. Das isoliert perfundierte Eutermodell geht im Hinblick auf die In-vivo-Verhältnisse über die In-vitro-Modelle hinaus. Sein Einsatz ermöglichte die Testung der Gewebereaktion auf die MgAg1%-Stäbchen in einem dynamischen Milieu, was zusammen mit den In-vitro-Modellen einen vollständigeren Überblick über Auswirkungen der MgAg1%-Stäbchen im Euter verschafft, ohne Tierversuche einzusetzen. Die antibakterielle Wirkung von unterschiedlichen Konzentrationen an AgNO3 und verschiedener Volumina an Degradationsmedium der MgAg1%-Stäbchen wurde erfolgreich bewertet. Der zeigte eine 5-fach niedrigere Zahl an Bakterienkolonien (E. coli und S. aureus) im Vergleich zu nicht behandelten Kontrollbakterien. Der BRT-MRL-Screening-Test zeigte eine Hemmung von Geobacillus stearothermophilus ab AgNO3-Konzentrationen von 0,01 mmol / l. Die eine Degradationsmedium (3 ml) gemessene Silber Konzentrationen erreicht somit eine antibakterielle wirksame Konzentrationen. In Bezug auf die 3 ml Volumen bis zu 1 ml Volumen des Abbaus Medium gleich 0,02 war - 1 mmol / l, die bereits gezeigt, antibakterielle Wirkung. Zusammenfassend wurde ein Ex-vivo- und In-vitro-System zur Testung von MgAg1%- Legierungen erfolgreich etabliert. Die Ergebnisse hinsichtlich Biokompatibilität, und antibakterieller Wirkung waren zufriedenstellend. Weitergehende Fragen sind jedoch noch nicht beantwortet, beispielsweise ob die Stäbchen gleichzeitig mit oder anstelle von Antibiotika verwendet werden sollten und für welche Arten der Mastitis sie sich eignen. Obwohl unsere Studie eine gute Biokompatibilität, einen guten Degradationsverlauf und eine hohe antibakterielle Wirkung zeigt, könnte versucht werden, in weiteren Untersuchungen noch höhere Konzentrationen zu erzielen.

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Nomier, Yousra Ahmed Reyad: In vitro and ex ovo studies of biocompatibility of magnesium-silver alloys and their antimicrobial effects on bovine bacterial species. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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