Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Bedeutung des bovinen Tetraspanins CD9 für den Eintritt des Virus der bovinen Virusdiarrhoe in die Wirtszelle

Pannhorst, Katrin

Bovine viral diarrhea virus (BVDV), Classical swine fever virus (CSFV) and Border disease virus (BDV) belong to the genus Pestivirus within the family Flaviviridae. The host range of pestiviruses is restricted to cloven hoofed animals (Artiodactyla) causing disease in ruminants (Bos, Ovis, and Camelidae) and nonruminants (Suidae). The early stage of viral infection, including virus binding and virus entry into host cells, is of crucial importance for the understanding of cell tropism and pathogenesis. BVDV enters into susceptible cells via clathrin-dependent endocytosis, involving heterodimers of the envelope glycoproteins E1 and E2 as viral key players. Besides multiple putative cellular receptors, the surface molecule CD46 of bovine cells (boCD46) was identified to be a receptor for BVDV. However, it seems that boCD46 alone is not sufficient to mediate an infection. In fact, infection with BVDV seems to be a multiple-step process in which more than one factor is involved. Investigations with monoclonal antibodies (mabs) that inhibit BVDV infection in a specific and dose-dependent manner provided evidence for another receptor candidate. The characterization of the corresponding antigen led to the identification of the bovine CD9 (boCD9), a member of the tetraspanin superfamily. Tetraspanins are membrane proteins that interact with distinct surface proteins building tetraspanin-enriched microdomains within the cytoplasma membrane. Furthermore, they can also be found intracellularly, e.g. in different vesicles which are involved in the intracellular transport. In viral replication cycles, tetraspanins can affect post-entry steps like morphogenesis, release of virus particles or syncytium formation. But they can also act as virus receptors. Tetraspanins are structurally characterized by four hydrophobic transmembrane regions and two extracellular domains, known as large and small extracellular loops (LEL and SEL, respectively). The aim of this study was to clarify whether boCD9 is a receptor or a component of the receptor complex for BVDV which promotes BVDV entry into host cells. To analyze the role of boCD9, expression experiments of putative receptor molecules in heterologous cells as well as inhibition studies with soluble tetraspanin LEL fusion proteins were performed. For transient expression of boCD9 the porcine kidney cell line SK6 was used. In addition to single expression of boCD9, a co-expression with boCD46 was included. Qualitative and quantitative analysis of virus-positive cells showed that single expression of boCD9 had no effect on the amount of infected cells. Compared to the amount of infected cells after single expression of boCD46, co-expression of boCD9 and boCD46 led to an additional increase of infected cells. This effect of boCD9 was not due to an increased entry of BVDV in coexpressing SK6 cells, since there was no difference between the RNA concentration of boCD46 expressing and co-expressing SK6 cells 1 h post infectionem. Furthermore, boCD9 had no significant effect on viral replication. The data of this study indicate that boCD9 is not a primary receptor, or a crucial component of the BVDV receptor complex which leads to an increased entry into host cells. Rather, boCD9 could have an effect on a subsequent stage in the BVDV life-cycle, e.g. on cell-cell transmission within the infected cell culture, maybe due to a binding of viral proteins. The recombinant soluble tetraspanin LEL fusion proteins GST-CD9 LEL and CD9 LEL inhibited BVDV infectivity in a dose dependent manner. Inhibition occurred if the virus was preincubated with these proteins prior to infection but not if the permissive bovine cell cultures were preincubated. Therefore, this effect might be due to a specific binding of these proteins to a BVDV envelope glycoprotein. The identification and interaction with such proteins as well as the mechanism of boCD9 after BVDV entry into host cells need to be analyzed in future studies. However, it is likely that boCD9 plays a role during the replication cycle of BVDV after virus entry. Above all, it is already known for CD9 and other tetraspanins that they are involved in post-entry steps in the replication cycle of e.g. Canine distemper virus (CDV), Feline immunodeficiency virus (FIV) and Human immunodeficiency virus (HIV).

Das Virus der Bovinen Virusdiarrhoe (BVD-Virus) gehört zusammen mit dem Virus der klassischen Schweinepest (KSPV) und dem Border-Disease-Virus der Schafe (BDV) zum Genus Pestivirus innerhalb der Familie Flaviviridae. Das Wirtsspektrum der BVD-Viren umfasst ausschließlich Paarhufer (Artiodactyla). Neben Rindern können auch Schafe, Ziegen, Schweine und wildlebende Wiederkäuer infiziert werden. Für das Verständnis des Zelltropismus und der Pathogenese ist die Kenntnis, der an der Virusbindung und dem Viruseintritt beteiligten Strukturen, von herausragender Bedeutung. BVD-Viren gelangen uber eine clathrinabhängige, rezeptorvermittelte Endozytose in die Wirtszelle, bei der die Hüllglykoproteine E1 und E2 eine Rolle spielen. Neben mehreren putativen zellularen Rezeptormolekülen wurde das Oberflächenmolekül CD46 boviner Zellen (boCD46) als Rezeptor des BVD-Virus identifiziert. Allerdings weisen mehrere Beobachtungen darauf hin, dass dieser Rezeptor vermutlich nicht alleine die Infektion vermitteln kann. Vielmehr scheint es sich bei der Infektion von BVD-Viren um einen mehrschrittigen Prozess zu handeln, an dem mehr als ein zellulärer Faktor beteiligt ist. Untersuchungen mit monoklonalen AK (mAK), welche die BVD-Virusinfektion spezifisch und konzentrationsabhängig inhibierten, lieferten Hinweise auf einen weiteren Rezeptorkandidaten. Die Charakterisierung des korrespondierenden Antigens führte zur Identifizierung des bovines CD9 (boCD9), ein Mitglied der Tetraspanin Superfamilie. Tetraspanine sind Membranproteine, welche mit multiplen Partnerproteinen interagieren und zur Bildung sogenannter tetraspanin-enriched microdomains innerhalb der Plasmamembran führen. Sie sind jedoch auch intrazellulär zu finden, u.a. in verschiedenen Vesikeln, welche am intrazellulären Transport beteiligt sind. In viralen Replikationszyklen können sie an Schritten nach dem Viruseintritt, z.B. bei der Morphogenese, Freisetzung von Viruspartikeln und der Synzytiumbildung beteiligt sein, aber auch als Virusrezeptoren wirken. Strukturell sind Tetraspanine durch vier hydrophobe Transmembrandomänen und zwei extrazellulären Domänen, der großen und der kleinen extrazellulären Schleife (large extracellular loop, LEL; small extracellular loop, SEL), charakterisiert. In der vorliegenden Arbeit sollte die Frage geklärt werden, ob boCD9 ein Rezeptor oder ein Teil des Rezeptorkomplexes für das BVD-Virus ist und seinen Eintritt in die Zelle fordert. Zur Klärung wurde sowohl die Expression putativer Rezeptormoleküle in heterologen Zellen als auch Inhibitionsstudien mit löslichen Tetraspanin LEL-Fusionsproteinen durchgeführt. Für die heterologe transiente Expression wurde die porzine Nierenzelllinie SK6 verwendet. Neben der Einzelexpression von boCD9 wurde auch eine Koexpression mit boCD46 durchgeführt. Sowohl die qualitative, als auch die quantitative Darstellung viruspositiver Zellen zeigte, dass die alleinige Expression von boCD9 keinen Effekt auf die Anzahl viruspositiver Zellen hatte. Wurde boCD9 allerdings zusammen mit boCD46 exprimiert, so wurde eine größere Anzahl virusinfizierter Zellen detektiert als nach alleiniger Expression von boCD46. Dieser Effekt war nicht auf einen vermehrten Eintritt von BVD-Virus in boCD9 + boCD46-exprimierenden SK6-Zellen zurückzuführen, da hinsichtlich der RNA-Konzentration 1 h post infectionem kein Unterschied zwischen boCD46-exprimierenden und koexprimierenden SK6-Zellen bestand. Darüber hinaus wurde auch kein signifikanter Effekt von boCD9, im Zusammenhang mit der Expression von boCD46, auf die Virusreplikation erkannt. Die Daten dieser Arbeit zeigen, dass boCD9 als alleiniges Rezeptormolekül, als auch als eine ausschlaggebende Komponente des BVD-Virus Rezeptorkomplexes, welche zu einem vermehrten Eintritt in die Wirtszelle fuhrt, auszuschließen ist. Vielmehr wird ihm ein Effekt auf die Virusinfektion nach dem Viruseintritt zugeordnet. Denkbar wäre ein Einfluss auf die Verbreitung des Virus innerhalb der infizierten Zellkultur von Zelle zu Zelle, möglicherweise durch eine Bindung an virale Proteine. Die Untersuchungen mit Tetraspanin LEL-Fusionsproteinen zeigten, dass das rekombinante Fusionsprotein GST-CD9 LEL, als auch das Protein CD9 LEL zu einer konzentrationsabhängigen Inhibition der BVD-Virusinfektion führten. Eine Inhibition trat bei Präinkubation von BVD-Viruspartikeln mit Tetraspanin LEL-Fusionsproteinen auf, jedoch nicht bei Präinkubation permissiver boviner Zellkulturen. Daher ist dieser Effekt möglicherweise auf eine spezifische Bindung der Proteine an ein virales Hüllglykoprotein zurückzuführen. Für die Identifizierung dieser viralen Proteine, sowie fur die Charakterisierung des Mechanismus von boCD9 auf die BVD-Virusinfektion nach dem Viruseintritt in die Wirtszelle müssen weitere Untersuchungen angeschlossen werden. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass boCD9, wie CD9 oder andere Tetraspanine bei Infektionen u.a. des Canine-Distemper-Virus (CDV), des felinen Immundefizienzvirus (FIV) und des humanen Immundefizienzvirus (HIV), innerhalb der Zelle eine Rolle wahrend des Replikationszyklus des BVD-Virus einnimmt.

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Pannhorst, Katrin: Bedeutung des bovinen Tetraspanins CD9 für den Eintritt des Virus der bovinen Virusdiarrhoe in die Wirtszelle. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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