Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Adaptation of avian influenza viruses to the porcine differentiated respiratory epithelium

Punyadarsaniya, Darsaniya

Swine are important hosts for the epidemiology and interspecies transmission of influenza A viruses; they are considered to serve as “mixing vessels” for the reassortment of genetic material from human, porcine, and avian influenza viruses. The differentiated cells of the respiratory epithelium are the primary target cells for these viruses. Influenza viruses use the surface protein haemagglutinin (HA) for binding to sialic acid residues presented by epithelial cells of the respiratory tract. Continuous cell lines lack several characteristics of the differentiated respiratory epithelium (ciliary activity, mucus production). To obtain more information about the initial interaction of influenza viruses with host cells in the respiratory tract, we have established a culture system for well-differentiated respiratory epithelial cells from the porcine lung. Porcine precision-cut lung slices (PCLS) maintain the well-differentiated epithelial cells in their original setting. Culture systems for such cells have been described and used to analyze infection by human and avian influenza viruses. Comparable studies with porcine airway epithelial cells have not been reported. PCLS were prepared by filling the cranial lobe, middle lobe and intermediate lobe with warm low-melting agarose followed by solidification on ice. The Krumdieck tissue slicer was used to prepare slices about 250 µm thick from the lungs of 3 months old pigs. Swine PCLS were used (i) to analyze the infection of differentiated respiratory epithelial cells by porcine (H3N2) and avian influenza viruses (H7N7 and H9N2) and (ii) to study the adaption of avian influenza viruses, subtype H9N2, to porcine airway epithelial cells. The adaptation process was analyzed by passaging the H9N2 virus three times in precision-cut slices prepared from the porcine lung. Results obtained in this study show that epithelial cells of PCLS are viable for more than ten days as indicated by (i) the ciliary activity, (ii) reversible bronchoconstriction after induction by methacholine, and (iii) a live/dead viability/cytotoxicity assay. Infection was characterized by immunostaining. Anti-nucleoprotein antibody was used for detection of swine or avian influenza virus antigen in cryosections of infected lung slices incubated for 1 day at 37°C after infection. For each group, six slices were used for monitoring the ciliostatic effect and for titration of the supernatant over a time period of a week. PCLS were stained for the presence of sialic acids using lectins from Maackia amurensis (MAA) to determine a 2,3-linked sialic acids and from Sambucus nigra (SNA) to determine a2,6-linked sialic acids. The ciliated epithelial cells were found to express both a2,3-linked sialic acid and a2,6-linked sialic acid. A comparison of the infection by a porcine (H3N2 subtype) and two avian viruses (H7N7 and H9N2 subtype) showed that the avian viruses were inferior in the following parameters: (i) production of infectious virus, (ii) duration of growth cycle, (iii) ciliostatic effect, and (iv) spectrum of infected cells (ciliated cells/mucus-producing cells). Compared to avian viruses, infection by swine influenza virus was characterized by higher yields of infectious virus (at least tenfold) and a shorter growth cycle. Infections by swine influenza virus and the H9N2 virus, respectively, were limited to the epithelial cells lining the bronchus; H7N7-infected cells were also detected in submucosal cell layers. Swine influenza virus (H3N2 subtype), avian influenza virus (H7N7 and H9N2 subtype) and adapted H9N2 viruses (all three passages) can infect ciliated epithelial cells in swine PCLS. Swine influenza virus (H3N2 subtype) and avian influenza virus (H7N7 subtype) can infect mucus producing cells in PCLS. In the adaptation study, with the first passage virus, staining of avian influenza virus (H9N2)-infected cells was detected only with ciliated cells, the second and third passage viruses behaved like the porcine H3N2 virus, i.e. they infected also mucus-producing cells. Therefore, this system is suitable to characterize the infection of porcine airway epithelial cells by influenza viruses from different host species. The results show that the duration of the growth cycle and the spectrum of infected cells are the first parameters that are affected during adaptation of the avian H9N2 virus to growth in porcine respiratory eptihelial cells. In the future, mutations within the genomic RNA of the avian H9N2 virus should be determined in order to identify the proteins and amino acids critical for adaptation to the porcine respiratory epithelium.

Schweine sind wichtige Wirte für die Epidemiologie und Interspezies-Übertragung von Influenza-A-Viren; sie gelten als “Mischgefäß” für die Neusortierung von genetischem Material aus humanen, porzinen und aviären Influenzaviren. Differezierte Zellen des respiratorischen Epithels stellen die primären Zielzellen für diese Viren dar. Influenzaviren nutzen das Oberflächenprotein Hämagglutinin (HA) für die Bindung an Sialinsäuren auf der Oberfläche von Epithelzellen des Respirationstrakts. Permanenten Zelllinien fehlen mehrere Charakteristika von differenzierten respiratorischen Epithelzellen (Zilienschlag, Mukus-Produktions). Um mehr Informationen über die initiale Interaktion von Influenzaviren mit Wirtszellen im Respirationstrakt, haben wir ein Kultursystem für enddifferenzierte respiratorische Epithelzellen aus der Schweinelunge etabliert. Porzine Lungenpräzisionsschnitte (PCLS) erhalten die enddifferentzierten Epithelzellen in ihrer ursprünglichen Zusammensetzung. Kultursysteme für solche Zellen sind beschrieben und genutzt worden, um die Infektion durch humane und aviäre Influenzaviren zu analysieren. Vergleichbare Studien mit porzinen Atemwegsepithelzellen wurden noch nicht berichtet. PCLS wurden erzeugt, indem der Lobus mit niedrig-schmelzender Agarose gefüllt wurde, die anschließend auf Eis verfestigt wurde. Der Krumdieck Gewebeschneider wurde genutzt, um 250 µm dicke Schnitte von der Lunge drei Monate alter Schweine herzustellen. Präzisionsschnitte von der Schweinelunge wurden genutzt (i) um die Infektion differenzierter respiratorischer Epithelzellen durch porzine (H3N2) und aviäre (H7N7, H9N2) Influenzaviren zu analysieren und (ii) um die Adaptation aviärer Influenzaviren des H9N2-Subtyps an porzine Atemwegsepithelzellen zu untersuchen. Für die Analyse des Adaptationsprozesses wurde das H9N2-Virus drei Mal in Präzisionsschnitten aus der Schweinelunge passagiert. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass Epithelzellen von PCLS mehr als zehn Tage lebensfähig sind, wie sich an folgenden Parametern zeigt: (i) Zilienaktivität, (ii) reversible Bronchokonstriktion nach Induktion durch Metacholin, (iii) Lebend/tot-Färbung. Die Infektion wurde durch Immunfärbung charakterisiert. Ein Anti-Nukleoprotein-Antikörper wurde genutzt für den Antigen-Nachweis von porzinen und aviären Influenzaviren in Kryoschnitten von Lungenschnitten, die nach der Infektion einen Tag bei 37°C inkubiert worden waren. Für jede Gruppe wurden sechs Schnitte verwendet, um den ziliostatischen Effekt zu verfolgen und um das Virus im Überstand über eine Zeitspanne von einer Woche zu titrieren. PCLS wurden auf das Vorhandensein von Sialinsäuren gefärbt, wobei das Lektin von Maackia amurensis (MAA) genutzt wurde, um a 2,3-verknüpfte Sialinsäure nachzuweisen und das Lektin von Sambucus nigra (SNA) für den Nachweis von a2,6-verknüpfter Sialinsäure. Es wurde gefunden, dass zilientragende Epithelzellen sowohl a2,3- als auch a2,6-verknüpfte Sialinsäure exprimieren. Ein Vergleich der Infektion durch ein porzines (H3N2-Subtyp) and zwei aviäre Viren (H7N7- and H9N2-Subtyp) ergab, dass die aviären Viren in folgenden Parametern unterlegen waren: (i) Freisetzung infektiöser Viren, (ii) Dauer des Wachstumszyklus (iii) ziliostatischer Effekt, and (iv) Spektrum infizierter Zellen (zilientragende Zellen, mukus-produzierende Zellen). Im Vergleich zu aviären Viren, war die Infektion durch Schweineinfluenzaviren charakterisiert durch höhere Viruserträge (mindestens zehnfach) und einen kürzeren Wachstumszyklus. Infektionen durch das Schweineinfluenzavirus und das aviäre H9N2-Virus waren begrenzt auf die Epithelzellen, die den Bronchus auskleiden; H7N7-infizierte Zellen wurden auch in submukosalen Zellschichten gefunden. Schweineinfluenzavirus (H3N2-Subtyp), aviäre Influenzaviren (H7N7 and H9N2 Subtyp) and adaptierte H9N2-Viren (all three passages) können in PCLS zilientragende Epithelzellen infizieren. Schweine-Influenza-Virus (H3N2-Subtyp) and aviäres Influenzavirus (H7N7-Subtyp) können in PCLS mukus-produzierende Zellen infizieren. In der Adaptationsstudie wurde aviäres Influenzavirus nur in zilientragenden Zellen nachgewiesen, Viren der zweiten und dritten Passage verhielten sich wie das porzine H3N2-Virus, d.h. sie infizierten auch mukus-produzierende Zellen. Deshalb ist dieses System geeignet, um die Infektion porziner Atemwegsepithelzellen durch Influenzaviren von verschiedenen Wirtsspezies zu charakterisieren. Die Ergebnisse zeigen, dass der Wachstumszyklus und das Spektrum infizierter Zellen die ersten Parameter sind, die von der Adaptation aviärer H9N2-Viren an das Wachstum in porzinen respiratorischen Epithelzellen betroffen sind. In künftigen Arbeiten sollen die Mutationen in der genomischen RNA des aviären H9N2-Virus bestimmt werden, um die Proteine und Aminosäuren zu identifizieren, die bei der Adaptation an das porzine respiratorische Epithel eine entscheidende Rolle spielen.

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Punyadarsaniya, Darsaniya: Adaptation of avian influenza viruses to the porcine differentiated respiratory epithelium. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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