Detektion dopingrelevanter anaboler Steroide in Pferdeurin und Pferdeplasma mithilfe eines Reportergen-Assays in Hefezellen

Anabole Steroide sind in der Lage, die sportliche Leistungsfähigkeit zu beeinflussen und aus diesem Grund ist der Einsatz im Pferdesport verboten. Der Nachweis anaboler Steroide erfolgt unter Verwendung von Gaschromatographie kombiniert mit Massenspektrometrie. Diese Methode der Analytik setzt voraus, dass die Struktur der nachzuweisenden Substanz bekannt ist. Vor diesem Hintergrund spielt der Metabolismus von Substanzen eine besondere Rolle, da der Nachweis einer Steroidapplikation teilweise nicht über die Substanz selbst sondern über bestimmte Metaboliten erfolgt. In diesem Fall müssen die Metabolisierungswege und die Struktur der Metaboliten ebenfalls bekannt sein. In diesem Kontext stellen Bioassays eine nützliche, unterstützende Methode dar, da sie anabole Steroide anhand ihrer androgenen Aktivität detektieren, unabhängig von ihrer Struktur. In der vorliegenden Arbeit wurde mit einem Saccharomyces cerevisiae-Stamm gearbeitet, der stabil mit dem humanen Androgenrezeptor transfiziert ist.  Die Hefezellen tragen zudem ein Plasmid mit Androgen-responsiven Elementen, die die Expression des LacZ-Gens, des Reportergens, kontrollieren. Das Produkt dieses Gens ist das Enzym ß-Galactosidase. Sobald eine Substanz den Androgenrezeptor aktiviert kann das Genprodukt synthetisiert werden. Das Enzym hydrolysiert den Farbstoff Chlorophenolrot-ß-D-galactopyranosid, was in Form eines Farbumschlags erfasst werden kann. Zunächst wird der Einfluss von Pferdeurin und Pferdeplasma auf die Hefezellen untersucht. Zu diesem Zweck wird das Kulturmedium der Hefezellen stufenweise durch eine steigenden Anteil Pferdeurin bzw. Pferdeplasma ersetzt und die Signale nach Zusatz einer konstanten DHT-Konzentration verglichen. Als nächstes werden Pferdeurin und Pferdplasma mit verschiedenen Konzentrationen anaboler Steroide versetzt und deren Detektion mithilfe des Assays überprüft. Um die Spezifität dieser Methode zu überprüfen, werden die Substanzen 17ß-Estradiol, Dexamethason, Progesteron und Aldosteron eingesetzt. Clenbuterol wird als Substanz mit anaboler Wirkung aber ohne Steroidstruktur eingesetzt. Der in-vivo-Teil dieser Arbeit berücksichtigt den Aspekt der Metabolisierung. Insgesamt sechs Pferde werden in einem cross-over-Studiendesign mit Testosteron und Nandrolon behandelt und in gewissen Abständen werden Urin- und Blutproben entnommen. Die gemessene androgene Aktivität in diesen Proben setzt sich aus der der Substanz selbst und den jeweiligen noch aktiven Metaboliten zusammen, was insbesondere dann von Bedeutung ist wenn die Struktur der Metaboliten oder der Substanz selbst nicht bekannt ist. Zudem besteht aufgrund der Detektion aktiver Metaboliten die Möglichkeit einer verlängerten Detektionszeit, verglichen mit den Methoden der Routineanalytik.