Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Detektion dopingrelevanter anaboler Steroide in Pferdeurin und Pferdeplasma mithilfe eines Reportergen-Assays in Hefezellen

Reupke, Verena

Anabolic steroids have the capability of improving athletic performance and are therefore banned substances in equestrian competitions. The classical analytical method of observing their abuse is gas chromatography combined with mass spectrometry. The prerequisite for this kind of analysis is that the structure of the substance which is searched for is known exactly. The metabolism of substances plays an important role against the background of this structure-based analytical method because the ways of metabolism and the structure of the metabolites have to be known in detail. Bioassays are valuable tools for observing the illegal use of anabolic steroids in equine sports as they work on the basis of the androgenic activity of anabolic androgenic steroids. In this case the yeast strain Saccharomyces cerevisiae is stably transfected with the androgen receptor. Moreover the cells carry a plasmid with androgen-responsive elements controlling the LacZ gene. The product of this gene is the enzyme ß-galactosidase. Thus, the reporter gene is activated as soon as a substance interacts with the androgen receptor, which is detectable by the gene product hydrolysing chlorophenol red ß-D-galactopyranoside, resulting in a change in color. First the influence of equine urine and plasma on the yeast cells is tested, therefore the culture medium is replaced by increasing percentages of urine or plasma spiked with a constant concentration of DHT as the biologically most active metabolite of testosterone. In the next step blank urine and plasma are spiked with different concentrations of some anabolic androgenic steroids. To show that this assay works on the basis of the androgenic activity of a substance blank urine samples are spiked with the steroids 17ß-Estradiol, Dexamethason, Progesteron and Aldosteron. These hormones are structurally related to anabolic androgenic steroids but they interact with different structures. Clenbuterol, a ß2-agonist, is tested as a substance with anabolic properties without structural similarity to steroid hormones. The in-vivo part of the study takes the aspect of metabolism into account. Six horses are treated with Testosteron and with Nandrolon in a cross-over study design. The androgenic activity measured comprises the activities of the substance itself and all its metabolites interacting with the androgen receptor. If the activity is due to unknown substances or metabolites their detection is only possible in this activity-based assay and detection times in this system may even be longer than those obtained by the routine analytical methods.

Anabole Steroide sind in der Lage, die sportliche Leistungsfähigkeit zu beeinflussen und aus diesem Grund ist der Einsatz im Pferdesport verboten. Der Nachweis anaboler Steroide erfolgt unter Verwendung von Gaschromatographie kombiniert mit Massenspektrometrie. Diese Methode der Analytik setzt voraus, dass die Struktur der nachzuweisenden Substanz bekannt ist. Vor diesem Hintergrund spielt der Metabolismus von Substanzen eine besondere Rolle, da der Nachweis einer Steroidapplikation teilweise nicht über die Substanz selbst sondern über bestimmte Metaboliten erfolgt. In diesem Fall müssen die Metabolisierungswege und die Struktur der Metaboliten ebenfalls bekannt sein. In diesem Kontext stellen Bioassays eine nützliche, unterstützende Methode dar, da sie anabole Steroide anhand ihrer androgenen Aktivität detektieren, unabhängig von ihrer Struktur. In der vorliegenden Arbeit wurde mit einem Saccharomyces cerevisiae-Stamm gearbeitet, der stabil mit dem humanen Androgenrezeptor transfiziert ist.  Die Hefezellen tragen zudem ein Plasmid mit Androgen-responsiven Elementen, die die Expression des LacZ-Gens, des Reportergens, kontrollieren. Das Produkt dieses Gens ist das Enzym ß-Galactosidase. Sobald eine Substanz den Androgenrezeptor aktiviert kann das Genprodukt synthetisiert werden. Das Enzym hydrolysiert den Farbstoff Chlorophenolrot-ß-D-galactopyranosid, was in Form eines Farbumschlags erfasst werden kann. Zunächst wird der Einfluss von Pferdeurin und Pferdeplasma auf die Hefezellen untersucht. Zu diesem Zweck wird das Kulturmedium der Hefezellen stufenweise durch eine steigenden Anteil Pferdeurin bzw. Pferdeplasma ersetzt und die Signale nach Zusatz einer konstanten DHT-Konzentration verglichen. Als nächstes werden Pferdeurin und Pferdplasma mit verschiedenen Konzentrationen anaboler Steroide versetzt und deren Detektion mithilfe des Assays überprüft. Um die Spezifität dieser Methode zu überprüfen, werden die Substanzen 17ß-Estradiol, Dexamethason, Progesteron und Aldosteron eingesetzt. Clenbuterol wird als Substanz mit anaboler Wirkung aber ohne Steroidstruktur eingesetzt. Der in-vivo-Teil dieser Arbeit berücksichtigt den Aspekt der Metabolisierung. Insgesamt sechs Pferde werden in einem cross-over-Studiendesign mit Testosteron und Nandrolon behandelt und in gewissen Abständen werden Urin- und Blutproben entnommen. Die gemessene androgene Aktivität in diesen Proben setzt sich aus der der Substanz selbst und den jeweiligen noch aktiven Metaboliten zusammen, was insbesondere dann von Bedeutung ist wenn die Struktur der Metaboliten oder der Substanz selbst nicht bekannt ist. Zudem besteht aufgrund der Detektion aktiver Metaboliten die Möglichkeit einer verlängerten Detektionszeit, verglichen mit den Methoden der Routineanalytik.

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Reupke, Verena: Detektion dopingrelevanter anaboler Steroide in Pferdeurin und Pferdeplasma mithilfe eines Reportergen-Assays in Hefezellen. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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