Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Entwicklung eines multiplex real-time PCR-Protokolls zum Nachweis von Koi-Herpesvirus (KHV) und Untersuchungen zur Pathogenese der Koi-Herpesvirus-Infektion bei experimentell infizierten Spiegelkarpfen (Cyprinus carpio)

Riechardt, Meike Cornelia Martina Ulrike

The koi herpesvirus (KHV) disease has caused severe losses in the aquaculture of common carp and koi since the 1990s. After virus isolation and electronic microscopy, KHV-diagnosis methods have been improved substantially by the development of conventional KHV-PCR assays. A further advancement of this specific genomic detection method was the development of a real-time PCR assay by GILAD et al. (2004). In the presented work GILAD's real-time PCR for the first time was used as a multiplex real-time PCR protocol, which allows the specific and sensitive detection of KHV-genome and an internal control-DNA according to HOFFMANN et al. (2006) simultaneously. A limit of detection of 10 copies of KHV-genome equivalents for GILAD's PCR has been confirmed for the multiplex real-time PCR protocol as well. 1 copy of KHV specific DNA can be detected occasionally using this method and 10 to 1010 copies of KHV-DNA can be detected reliable. An universal internal control DNA, which is added at the DNA extraction process and co-amplificated during the multiplex PCR, was introduced as a quality control for both, the DNA extraction procedure and the amplification process as well. Furthermore, the multiplex PCR approach facilitates the fast and easy absolute quantification of target DNA in the samples. Comparative analyses of the sensitivity of different PCR assays revealed that the developed multiplex real-time protocol performed as good as the protocols according to BERCOVIER et al. (2005) (conventional PCR), BERGMANN et al. (2006) (nested PCR) and PIKARSKY et al. (2004) (conventional PCR). Slightly less sensitive was the protocol according to GRAY et al. (2002) modified by YUASA et al. (2005) (conventional PCR) followed by the conventional PCR protocols according to GRAY al. (2002) and GILAD et al. (2002). In addition, the pathogenesis of the KHV infection was examined in order to improve the diagnosis of the KHV disease. Clinical diseased carp as well as reconvalescent carp were generated by laboratory infection of mirror carp. Both juvenile and adult carp were infected and cohabitated in order to compare the susceptibility of different age groups. The carp were kept at the permissive temperature of 23 °C and were treated with a bath infection using two different infection doses of KHV. During the course of the infection, the amount of KHV-DNA in periodically taken samples was determined by the quantitative multiplex real-time PCR protocol according to GILAD et al. (2004) and HOFFMANN et al. (2006). Depending on the infection dose, clinical signs and mortality different amounts of KHV-DNA were found in kidney, gill tissue, and for the first time in gill mucus and peripheral blood leucocytes (PBL). The higher infection dose induced stronger clinical signs and a faster and higher mortality but had only little influence on the amount of KHV-specific DNA in the samples. Only juvenile carp died, thus the age of infected carp is of vital importance. During the infection experiment juvenile carp were more susceptible to KHV disease than adult carp. Mortality always was associated with a very high virus load in fish tissue. In adult carp the highest amount of KHV-specific DNA was found during the clinical phase of infection. Over all, the DNA amount decreased in all tissue samples over the time. At 6 and 8 weeks post infection all samples of reconvalescent carp contained only a small amount of KHV-DNA, which indicates a latent or persistent stage of the herpesvirus in these fishes. The detection of KHV-DNA in PBL could possibly mean a systemic spread of the virus via these cells. But due to the fact that only DNA could be detected, this DNA might originate from virus which was destroyed by the immune system and was therefore no longer infectious to cells. The presence of KHV-DNA in gill mucus suggests a secretion of infectious virus into the water and could indicate a gill related fast spreading of the KHV disease. Since the kidney tissue showed the highest amount of KHV-specific DNA compared to the other analysed organs, kidney samples have to be regarded as the most reliable material for the KHV diagnosis using the specific genome detection. A disadvantage however was the lethal procedure of sample collection. Of the non-lethal sampling procedures, KHV-DNA could be detected in PBL in the most reliable and sensitive way. But in most PBL samples, there was only a low amount of KHV-DNA detectable. Furthermore, the effort related with PBL sampling and processing is high. The detection of KHV-DNA in gill tissue was found to be slightly less sensitive than in PBL. Otherwise, there were more high loaded samples and the gill tissue can be extracted and processed easily. The sampling of gill mucus is minimally invasive but in respect of both sensitivity and quantitative detection this material always gave the least accurate results compared to the other materials. Although singular gill mucus samples revealed a remarkable amount of KHV-DNA, the virus load in that particular material was found to be low in general. For comparison a few tissue samples were analysed by electron microscopy and by virus isolation and subsequent indirect immunofluorescence of blind passages. Neither the formation of a cpE nor KHV-specific immunofluorescence could be detected. In this study the quantitative multiplex real-time PCR detected KHV in a sensitive, specific and reliable manner.

Die Koi-Herpesvirus (KHV)-Infektion hat seit den 1990er Jahren große Schäden in der Aquakultur von Nutzkarpfen und Koi verursacht. Der KHV-Nachweis konnte mit der Entwicklung konventioneller PCRs gegenüber der Virusisolierung mittels Zellkultur und des elektronenmikroskopischen Nachweises von Viruspartikeln entscheidend verbessert werden. GILAD et al. (2004) entwickelten den genomischen Nachweis von KHV in Form eines real-time PCR-assays weiter. In der vorliegenden Untersuchung wurde die real-time PCR von GILAD et al. (2004) erstmals als multiplex real-time PCR-Protokoll verwendet, mit dem spezifisch und sensitiv KHV-Genom simultan zu einer internen Kontroll-DNA nach HOFFMANN et al. (2006) bestimmt werden kann. Das Detektionslimit von GILAD et al. (2004) von 10 Kopien KHV-Genomäquivalenten konnte mit dem entwickelten multiplex real-time PCR-Protokoll bestätigt werden. Mit dem vorliegenden Protokoll wurden fluktuierend 1 Kopie und verlässlich 10 bis 1010 Kopien KHV-Genomäquivalente gemessen. Die Verwendung und Koamplifikation einer universell einsetzbaren internen Kontrolle, die während der DNA-Extraktion hinzugefügt wird, ermöglicht die Qualitätskontrolle von DNA-Extraktion und PCR-Amplifikation. Mittels Koamplifizierung der internen Kontrolle wird die Sicherheit der diagnostischen Aussage erhöht, außerdem wird die schnelle und einfache absolute Quantifizierung der genomischen KHV-DNA in Probenmaterial überhaupt erst ermöglicht. Das multiplex real-time PCR-Protokoll stellte sich als vergleichbar sensitiv zu den Protokollen basierend auf BERCOVIER et al. (2005) (konventionelle PCR), BERGMANN et al. (2006) (nested PCR) und PIKARSKY et al. (2004) (konventionelle PCR) heraus. Die konventionellen PCRs nach GRAY et al. (2002) modifiziert nach YUASA et al. (2005) und zuletzt die PCRs nach GRAY et al. (2002) und GILAD et al. (2002) schnitten schlechter ab. Zusätzlich wurden in der vorliegenden Arbeit Untersuchungen zur Pathogenese der KHV-Infektion mit dem Ziel der Verbesserung der Diagnostik durchgeführt. Im Infektionsversuch wurden dafür Spiegelkarpfen mit KHV infiziert und im Verlauf sowohl klinisch erkrankte als auch rekonvaleszente Tiere untersucht. Parallel zu adulten Karpfen wurden juvenile Spiegelkarpfen zum Vergleich der Empfänglichkeit von verschiedenen Altersklassen infiziert und mit den adulten Karpfen zusammen gehältert. Die Karpfen wurden bei der für KHV permissiven Temperatur von 23 °C gehältert und mit zwei verschiedenen Infektionsdosen im Bad infiziert. Bei den adulten Spiegelkarpfen wurde zu regelmäßigen Beprobungszeitpunkten eine Untersuchung von Niere, Kieme, Kiemenabstrich und peripheren Blutleukozyten (PBL) durchgeführt. Mit dem entwickelten quantitativen multiplex real-time PCR-Protokoll nach GILAD et al. (2004) und HOFFMANN et al. (2006) wurde die Höhe des spezifischen KHV-DNA-Gehalts einer Probe bestimmt. Dabei ließ sich abhängig von Infektionsdosis, Klinik und Mortalität unterschiedlich viel KHV-DNA in den Materialien und damit erstmals auch im Kiemenabstrich und den peripheren Blutleukozyten (PBL) nachweisen. Die höhere Infektionsdosis bewirkte eine stärkere Klinik und eine schnellere und höhere Mortalität, sie hatte jedoch nur bedingt Einfluss auf den quantitativen Nachweis der KHV-DNA. Das Alter der im Versuch infizierten Karpfen hatte entscheidenden Einfluss auf die Ausprägung der Mortalität, nur juvenile Karpfen verstarben. Es konnte somit eine altersabhängige Resistenz für KHV beobachtet werden. Dabei konnte festgestellt werden, dass durch KHV verursachte Mortalität unabhängig vom Zeitpunkt nach der Infektion mit in einer sehr hohen Viruslast im Gewebe der juvenilen Karpfen einhergeht. Während der klinischen Phase der Infektion konnten die höchsten Konzentrationen an KHV-DNA der adulten Karpfen gemessen werden. Insgesamt nahm der DNA-Gehalt in allen Probenmaterialien und demnach auch im Karpfen über die Zeit hinweg ab. 6 und 8 Wochen nach der Infektion ist in den untersuchten Proben rekonvaleszenter Tiere nur noch ein sehr geringer KHV-DNA-Gehalt nachzuweisen, was für die Ausprägung einer latenten beziehungsweise persistenten Phase des Herpesvirus in diesen Karpfen spricht. Der Nachweis von KHV-DNA in aufgereinigten PBL spricht für die Möglichkeit der systemischen Verteilung des Virus durch diese Blutfraktion. Da es sich aber lediglich um den Nachweis von DNA handelt, könnte es sich aber auch nur um Teile des zerstörten Virus handeln, der von diesem Teil des Immunsystems bekämpft wurde. Der Nachweis von KHV-DNA im Kiemenschleim konkretisiert die Vermutung der Ausscheidung von infektiösem Virus durch die Kiemen und damit die kiemenvermittelte schnelle Weiterverbreitung des Virus im Wasser. Das Nierengewebe erscheint im Vergleich der untersuchten Materialien am verlässlichsten zum Nachweis von KHV, da es quantitativ am stärksten belastet war und einen sensitiven Nachweis von KHV-DNA aus den Proben erlaubte. Nachteilig stellt sich die ausschließlich letale Entnahme dar. Von den nicht-letal zu entnehmenden Proben konnte KHV-DNA in den PBL am verlässlichsten und sensitivsten nachgewiesen werden, wobei in dieser Probe fast immer nur verhältnismäßig geringe Mengen gemessen werden konnten. Ferner schlägt der hohe Aufwand der PBL-Probenentnahme und die PBL-Aufarbeitung negativ zu Buche. Das Kiemengewebe erwies sich für die Diagnostik als etwas weniger sensitiv als die PBL.  Kiemengewebe kann jedoch leicht entnommen und verarbeitet werden. Bei den untersuchten Kiemen fielen außerdem im Vergleich zu den PBL mehr hoch belastete Proben auf. Der Kiemenabstrich stellt die am wenigsten invasive Methode zur nicht-letalen Probenentnahme dar. Im Kiemenschleim gelang zwar der Nachweis von KHV-DNA, aber dieses Material wies die geringste Sensitivität auf. Vereinzelt konnten hohe Mengen an KHV-DNA gefunden werden. In der überwiegenden Anzahl der Kiemenschleimproben wurde jedoch nur eine geringe Viruslast gefunden Einige Proben des Infektionsversuchs konnten vergleichend mittels Elektronenmikroskopie, der Virusreisolierung und anschließendem Immunfluoreszenztest der Blindpassagen untersucht werden. In den Passagen des inokulierten Organmaterials konnten weder cpE noch Immunfluoreszenz beobachtet werden. Anhand der vorliegenden Ergebnisse wurde KHV mittels quantitativer multiplex real-time PCR sensitiv, zuverlässig und spezifisch nachgewiesen.

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Riechardt, Meike Cornelia Martina Ulrike: Entwicklung eines multiplex real-time PCR-Protokolls zum Nachweis von Koi-Herpesvirus (KHV) und Untersuchungen zur Pathogenese der Koi-Herpesvirus-Infektion bei experimentell infizierten Spiegelkarpfen (Cyprinus carpio). Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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