Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung zur Verbesserung der Kryokonservierbarkeit von Bullensperma durch den Zusatz von Liposomen zum Verdünner

Röpke, Torleif

In this study, the effect of various large unilamellar liposomes on pre-freeze and post-thaw quality of bovine spermatozoa compared to standard egg yolk freezing extender has been investigated. The lipids in the liposomes have different thermophysical properties which are primarily responsible for the cryoprotective effect of liposomes on cellular membranes. Semen was collected from eight bulls, that were held at the ‘Besamungsverein Neustadt a.d. Aisch eV’ in Neustadt/Aisch, and from five bulls, that were held at the Clinic for Cattle at the University of Veterinary Medicine Hannover. The unilamellar liposomes in this study were prepared in a diameter of 100 and 200 nm using a mini-extruder. Volume, cell concentration and motility of semen were evaluated. Subsequently semen was diluted with pre-warmed freezing extender I supplemented with either 8% clarified egg yolk or 4 mg/mL liposomes at 120 × 106 cells/mL. An equal amount of freezing extender II supplemented with or without egg yolk as well as 12.8% glycerol was added slowly, resulting in 60 × 106 cells/mL, 6.4% glycerol and either 8% egg yolk or 2 mg/mL liposomes. This suspension was equilibrated at 4oC during 6 or 24 h with agitation, after which it was filled in 0.25 mL straws. Straws were frozen in liquid nitrogen vapor at -95 oC for 9 min. Thawing of the straws was done in a water bath of 37 °C for 30 s. The percentage of progressively motile (PMOT) sperm was determined for extended and freeze-thawed sperm samples using computer assisted sperm analysis. A double staining with PI and FITC-PNA was performed and the plasma and acrosome intact (PMAI) sperm was assessed using a flow cytometer. Liposomes composed of unsaturated EPC or DOPC (18:1) protected sperm during cryopreservation assessed by PMAI- and PMOT-values after freeze-thaw. The portion of PMAI- and PMOT-sperm was higher (p < 0.05) using liposomes which consisted of EPC or DOPC and DOPG (negatively charged head group) compared to addition of DOPS (negatively charged) or DOPE (neutral), but lower (p < 0.05) compared to standard egg yolk freezing extender. Among the saturated lipids that were tested (DLPC, DMPC, DPPC, and DSPC; with 12, 14, 16 and 18 C-atoms, respectively) only DMPC showed cryoprotective properties. PMAI- and PMOT-values in freezing extender with DMPC liposomes were similar to the rates obtained with EPC and DOPC liposomes. However, the percentages of PMAI- and PMOT-sperm incubated with DMPC liposomes were lower (p < 0.05)compared to standard egg yolk freezing extender. No differences (p < 0.05) were observed in cryoprotective effects between 100 nm and 200 nm DMPC liposomes. The results of this study indicate that synthetic liposomes are in principle an appropriate addition to extender for cryopreservation of bovine sperm. Because the postthaw percentages of plasma and acrosome membrane intact and progressively motile spermatozoa cryopreserved using liposome-extender were lower compared to those using standard egg yolk extender, further studies are necessary before synthetic liposomes can be recommended for substitution of egg yolk in freezing extender.

In dieser Studie wurde die Wirkung von verschiedenen Sorten unilamellarer Liposomen auf die Qualität von bovinen Spermatozoen vor und nach der Kryokonservierung im Vergleich zu Eidotter untersucht. Die angewendeten Lipide zur Herstellung der Liposomen besitzen unterschiedliche thermophysikalische Eigenschaften, welche die protektiven Effekte von Liposomen auf Zellmembranen bei der Kryokonservierung beeinflussen können. Zur Gewinnung des Spermas standen acht Bullen der Rasse Deutsches Fleckvieh des Besamungsvereins Neustadt a.d. Aisch e.V. (BVN) und fünf Bullen der Besamungsstation der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung. Die in der Studie verwendeten Liposomen wurden mit Hilfe eines Mini-Extruders in einem Durchmesser von 100 und 200 nm geformt. Ejakulatvolumen, Dichte und Motilität des Samens wurden bestimmt und danach mit vorgewärmtem TRIS-Tiefgefrier (TG)-Verdünner I, ergänzt durch den Zusatz von 8% geklärtem Eigelb oder 4 mg/ml Liposomen, auf 120 × 106 Zellen/ml verdünnt. Direkt im Anschluss wurde die gleiche Menge TRIS-TG-Verdünner II mit und ohne Eigelb sowie 12,8% Glycerin langsam hinzugegeben, so dass das Endvolumen aus 60 × 106 Zellen/ml, 6,4% Glycerin und 8% Eigelb oder 2 mg/ml Liposomen bestand. Das verdünnte Sperma wurde für 6 bzw. 24 Stunden im 4 °C Kühlraum äquilibriert bevor es in 0,25 ml Pailletten abgefüllt wurde. Das Einfrieren der Besamungsportionen erfolgte im Stickstoffdampf bei -95 °C für 9 Minuten. Die Pailletten wurden im Wasserbad bei 37 °C für 30 s aufgetaut. Der prozentuale Anteil progressiv motiler (PMOT) Spermien wurde vor und nach der Kryokonservierung mittels computergestützter Motilitätsanalyse untersucht. Der Anteil plasmamembran- und akrosomintakter (PMAI) Spermien wurde durchflusszytometrisch nach FITC-PNA / PI-Färbung bestimmt. Liposomen, bestehend aus ungesättigtem EPC oder DOPC (18:1), zeigten einen ähnlich starken kryoprotektiven Effekt, beurteilt anhand der PMAI- und PMOT-Werte nach dem Auftauen. Die Anteile PMAI- sowie PMOT-Spermien waren bei der Verwendung von Liposomen, bestehend aus EPC bzw. DOPC mit DOPG (negativ geladene Kopfgruppe) höher (p < 0,05) als in der Kombination mit DOPS (negativ geladen) oder DOPE (neutral), jedoch niedriger (p < 0,05) als bei der Kryokonservierung mit dem herkömmlichen Eigelbverdünner. Von den aus gesättigten Lipiden (DLPC, DMPC, DPPC und DSPC; mit 12, 14, 16 und 18 C-Atomen) bestehenden Liposomen zeigten nur diejenigen aus DMPC kryoprotektive Eigenschaften. Die PMAI- und PMOT-Werte der Spermien im Verdünner mit DMPC Liposomen waren vergleichbar mit denjenigen, die mit EPC oder DOPC Liposomen inkubiert worden waren. DLPC Liposomen verursachten einen Abfall der PMAI- und PMOT-Werte auf nahezu Null unmittelbar nach der Verdünnung. Die PMAI- und PMOT-Werte waren aber auch bei Verwendung von DMPC Liposomen geringer (p < 0,05) als bei dem herkömmlichen Eigelbverdünner. Es waren keine Unterschiede (p > 0,05) in der kryoprotektiven Wirkung zwischen 100 und 200 nm großen DMPC Liposomen zu beobachten. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass synthetische Liposomen als Verdünnerzusatz zur Kryokonservierung boviner Spermien prinzipiell geeignet sind. Da jedoch die Anteile plasmamembran- und akrosomintakter bzw. progressiv motiler Spermien nach dem Einfrieren mittels Liposomen-Verdünner im Vergleich zum Eidotter-Verdünner reduziert waren, sind weitere Studien nötig, bevor synthetische Liposomen als Ersatz von Eidotter für Tiefgefrierverdünner empfohlen werden können.

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Röpke, Torleif: Untersuchung zur Verbesserung der Kryokonservierbarkeit von Bullensperma durch den Zusatz von Liposomen zum Verdünner. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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