Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Influence of paramyxovirus infection on phenotypical and functional characteristics of canine histiocytic sarcoma cells (DH82)

Sayed-Ahmed, Mohamed Zakaria

In the literature section a short overview about canine distemper virus, its hosts and the pathogenesis of canine distemper virus (CDV) infection is given. Additionally, a short overview about the properties of CDV and clinical and pathological changes related to the virus is provided. Furthermore, the characteristics of the CDV strains R252 and Onderstepoort in vitro are described. The classification and clinico-pathological features of canine parainfluenza virus (CPiV) are elucidated. Another part deals with the classification of canine histiocytic disorders, the comparison of canine histiocytic disorders regarding their cellular origin, most commonly affected organs and predisposed breeds. Additionally, a short overview about the characteristics of a canine histiocytic sarcoma cell line, termed DH82 cells, is given. Furthermore, mechanisms of anti-tumor effects, immune response and viral oncolysis are detailed. Finally, a review about cortactin structure, its interacting partners and its role in cell migration and invadopodia formation is given. In the current study, the percentage of CDV and CPiV infected Vero cells and DH82 cells were determined at 1, 3, 5 and 10 dpi using immunofluorescence. Furthermore, the morphological characteristics of infected cells were compared to non-infected controls using inverted microscopy, hematoxylin-eosin staining and scanning and transmission electron microscopy. The functionality was examined using latex particle phagocytosis. CDV- and CPiV-infected Vero and DH82 cells exhibited morphological changes with increasing percentage of infected cells between 1 and 10 days post infection (dpi) compared to non-infected controls. The percentage of virus infected cells increased over time in acutely infected cultures whereas persistently CDV-infected DH82 cells exhibited approximately 100% infected cells at all time points investigated. Regarding the proliferative activity, acutely CDV-Ond, CDV-R252, CDV-OndeGFP and CPiV infected DH82 cultures displayed lower absolute cell numbers and lower numbers of mitotic figures compared to non-infected controls at all time points. In contrast, there were no significant differences in the growth behaviour of non-infected and persistently CDV-Ond infected DH82 cells. In the second part of the study, the cortactin expression and distribution was comparatively investigated in non-infected and acutely as well as persistently CDV-Ond infected DH82 cells using immunofluorescence, confocal laser microscopy, immunoelectron microscopy and resverse transcription  quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). Immunfluorescence microscopy revealed, that approximately 100 % of these cells expressed cortactin, independently if they were virus infected or not. Interestingly, cortactin was mainly diffusely distributed in the cytoplasm of CDV-Ond, CDV-R252 and CPiV infected DH82 cultures whereas non-infected cells displayed a pronounced membrane-associated expression. On a molecular level, persistently CDV-Ond infected DH82 cells contained significantly less cortactin-mRNA transcripts than non-infected DH82 cells. Summarized, down-regulation of cortactin in CDV infected DH82 cells might be an indicator for a reduced ability of infected cells to migrate. Therefore, virus-mediated down-regulation and translocation of cortactin from cellular membranes to the cytoplasm might represent a metastasis preventing factor in canine histiocytic sarcomas.

Im Literaturteil der vorliegenden Arbeit wird ein kurzer Überblick über das kanine Staupevirus (CDV), betroffene Wirtstiere und die Pathogenese der kaninen Staupevirusinfektion gegeben. Darüber hinaus werden die Eigenschaften von CDV, sowie die durch das Virus verursachten klinischen und pathologischen Veränderungen dargestellt. Des Weiteren werden die Merkmale der CDV-Stämme R252 und Onderstepoort (Ond) in vitro beschrieben. Die Klassifizierung, sowie die klinisch-pathologischen Eigenschaften des kaninen Parainfluenzavirus (CPiV) werden dargestellt. Ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit befasst sich mit der Klassifizierung von histiozytären Erkrankungen des Hundes, wobei eine vergleichende Darstellung in Bezug auf ihren zellulären Ursprung, häufig betroffene Organe und prädisponierte Rassen erfolgt. Darüber hinaus wird ein Überblick über die Eigenschaften einer kaninen histiozytären Sarkom-Zelllinie, genannt DH82-Zellen, gegeben. Außerdem erfolgt eine detaillierte Darstellung der Mechanismen anti-tumoraler Eigenschaften, Immunantworten und viraler Onkolyse. Schließlich erfolgt eine zusammenfassende Darstellung über die Struktur von Cortactin, seine Interaktionspartner und seine Rolle bei der Zellmigration und Bildung von Invadopodien. In der vorliegenden Studie wurde der Anteil CDV- und CPiV-infizierter Vero- und DH82-Zellen an den Tagen 1, 3, 5 und 10 nach der Infektion mittels Immunfluoreszenz bestimmt. Darüber hinaus wurden die morphologischen Merkmale der infizierten Zellen mit denen der nicht-infizierten Kontrollen mittels Phasenkontrastmikroskopie, Hämatoxylin-Eosin-Färbung sowie Raster- und Transmissions-Elektronenmikroskopie verglichen. Die Funktionalität der Zellen wurde mit Hilfe der Latexpartikel-Phagozytose überprüft. Die CDV- und CPiV-infizierten Vero- und DH82-Zellen wiesen zunehmende morphologische Veränderungen mit steigendem Anteil infizierter Zellen im Zeitraum von 1 bis 10 Tagen nach der Infektion (dpi) im Vergleich zu nicht-infizierten Kontrollen auf. In akut infizierten Kulturen stieg der Anteil infizierter Zellen über die Zeit an, während zu allen Zeitpunkten die persistent mit CDV infizierten DH82-Zellen konstant zu ca. 100% infiziert waren. An allen untersuchten Zeitpunkten stellte sich die Proliferationsaktivität der akut CDV-Ond-, CDV-R252-, CDV-OndeGFP- und CPiV-infizierten DH82-Kulturen geringer dar als dies bei nicht-infizierten Kontrollen der Fall war. In ähnlicher Art und Weise lagen auch die absoluten Zellzahlen und die Anzahl der Mitosen infizierter Zellen unterhalb derjenigen nicht-infizierter Kontrollen. Im Gegensatz dazu gab es keine signifikanten Unterschiede im Wachstumsverhalten von nicht-infizierten und persistent CDV-Ond infizierten DH82 Zellen. Im zweiten Teil der Studie wurde die Expression und Verteilung von Cortactin vergleichend bei nicht-infizierten, akut sowie persistierend CDV-Ond infizierten DH82  Zellen mittels Immunfluoreszenz, konfokaler Laser-Mikroskopie, Immunelektronenmikroskopie und quantitativer reverser Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) untersucht. Mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass nahezu 100% aller Zellen Cortactin exprimierten, unabhängig davon, ob diese Zellen infiziert waren oder nicht. Interessanterweise war Cortactin hauptsächlich diffus im Zytoplasma der CDV-Ond-, CDV-R252- und CPiV-infizierten DH82 Kulturen verteilt, während nicht-infizierte Zellen eine ausgesprochen membran-assoziierte Expression aufwiesen. Auf molekularer Ebene enthielten persistent CDV-Ond-infizierte DH82 Zellen deutlich weniger Cortactin-mRNA-Transkripte als nicht infizierte DH82-Zellen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Herunterregulation von Cortactin in CDV-infizierten DH82-Zellen möglicherweise als Indikator für eine verminderte Migrationsfähigkeit der infizierten Zellen fungieren kann. Daher könnte die virusvermittelte Herabregulation und Translokation von Cortactin von der Zellmembran in das Zytoplasma einen Faktor zur Verhinderung der Metastasierung in kaninen histiozytären Sarkomen darstellen.

Zitieren

Zitierform:

Sayed-Ahmed, Mohamed Zakaria: Influence of paramyxovirus infection on phenotypical and functional characteristics of canine histiocytic sarcoma cells (DH82). Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export