Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Virusproteinexpression und Phänotypisierung der Immunantwort im zentralen Nervensystem von Seehundstaupevirusinfizierten Seehunden (Phoca vitulina)

Stimmer, Lev

In the literature section, a review about the classification of the morbillivirus genus as well as the host range, virus structure and replication of phocine distemper virus (PDV) is provided. Further, structure and function of virus genome and proteins as well as epidemiological and clinical aspects and pathogenesis of morbillivirus infection in marine mammals are described in this part. Special emphasis is given to PDVinduced epidemics in harbor seal populations in 1988 and 2002. Brain samples of 39 PDV-infected harbor seals, which died during distemper epidemics in 1988 (n = 16) and 2002 (n = 21) were investigated in the present study. Additionally, two brains of non-infected seals without neurological diseases served as reference material (controls). Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples of the cerebrum, midbrain, cerebellum, and medulla oblongata were examined by histology. Myelin integrity and demyelination, respectively, were detected by luxol fast blue/cresylviolet (LFB-KEV) special staining. Furthermore, antibodies specific for astrocytes (GFAP), T- and B- lymphocytes (CD3 and CD79α), and antigen presenting cells (MHC-II) were used for immunohistological phenotyping of immune cells in the central nervous system. Further, lysozyme- and MAC 387-specific antibodies and the lectin BS-1 were used for the detection of macrophages/microglia. For the investigation of N-, P-, M-, F-, and H-proteins morbillivirus- specific monoclonal and polyclonal antibodies were used. Additional sequential immunohistochemical double staining procedures were performed in order to identify the predominantly infected cell type in selected animals. To detect morbillivirus N-mRNA and P-mRNA by in-situhybridization, digoxigenin-labeled CDV-specific probes were used. Polioencephalitis in the cerebral cortex was the main histopathological finding in investigated seals. Histopathological changes in the cerebral grey matter were subclassified In two lesion types: (1) lesion type I, characterized by mild gliosis without perivascular infiltrations and (2) lesion type II, characterized by moderate gliosis and lymphohistiocytic perivascular infiltrations. Cerebral lesions were further characterized by immunohistochemistry. Inflammatory responses, dominated by CD3+ T-cells and activated microglia/macrophages were associated with a prominent MHC-II upregulation on endothelial and glial cells as well as on CNS-infiltrating leukocytes. The number of GFAP-expressing astrocytes was significantly increased in type II lesions in comparison to control animals. GFAPexpression was upregulated in intralesional astrocytes and in astrocytes within the adjacent neuroparenchyma. Morbillivirus N-, P-, M-, F- and H-proteins as well as N- and P-mRNA were found in CNS-lesions. Viral protein was found predominantly in neurofilament-expressing neurons and only occasionally in astrocytes within inflamed areas as demonstrated by immunohistochemical double labeling. The staining intensity and number of immunoreactive cells varied substantially between different viral proteins. The expression of viral M- and F-proteins was reduced in severely inflamed plaques. Comparison of viral protein and mRNA expression revealed a diminished amount of viral P-protein preferentially associated with perivascular inflammation. In summary, CNS lesions in PDV-infected seals are similar to CDV-induced acute polioencephalitis in dogs and measles virus inclusion body polioencephalitis in men, respectively. The significance of reduced viral protein detection in terms of a restricted viral protein expression as a mechanism of viral persistence as observed in other morbillivirus infections needs to be investigated in future studies.

In der Literaturübersicht wird neben der Klassifikation der Morbilliviren, ihrem Wirtsspektrum, Aufbau und ihrer Replikation eine Zusammenfassung über den Aufbau und die Eigenschaften des Seehundstaupevirus (PDV) gegeben. Ein besonderes Augenmerk liegt dabei auf der Darstellung der Struktur des Virusgenoms und Funktion der Virusproteine. Außerdem wird die Epidemiologie, Klinik und Pathogenese der Morbillivirusinfektionen bei marinen Säugetieren beschrieben. Hierbei wird insbesondere auf die PDV-Epidemien bei nordeuropäischen Seehunden in den Jahren 1988 und 2002 eingegangen. Außerdem werden PDV-induzierte klinische und pathologische Veränderungen sowie die Pathogenese der Virusinfektion bei dieser Tierart beschrieben. Für die Untersuchungen standen Proben von 39 Seehunden zur Verfügung. 16 der untersuchten Tiere verstarben während der Seehundstaupe-Epidemie im Jahr 1988 und 21 Seehunde während des Seuchenzuges im Jahr 2002. Die Gehirne von zwei nicht-PDV-infizierten Seehunden dienten als Kontrollen. Die histochemischen und immunhistologischen Untersuchungen sowie die in-situ-Hybridisierung wurden an Formalin-fixiertem und Paraffin-eingebettetem Gehirngewebe durchgeführt. Hierbei wurden die Schnitte neben einer Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung auch einer Luxol-Fast-Blue/Kresylechtviolett (LFB-KEV)-Färbung zur Darstellung von Demyelinisierungen unterzogen. Für die Immunhistologie wurden Antikörper zum Nachweis von Astrozyten (GFAP), T- und B-Lymphozyten (CD3 und CD79α) und des MHC-Klasse-II-Antigens (MHC-II) verwendet. Außerdem wurden Lysozym- und MAC 387-spezifische Antikörper und das Lektin BS-1 zum Nachweis von Makropha gen/Mikroglia benutzt. Für den immunhistologischen Nachweis der N-, P-, M-, F- und H-Proteine wurden monoklonale und polyklonale Antikörper verwendet. Zusätzlich wurden an ausgewählten Schnitten immunhistologische Doppelmarkierungen vorgenommen. Mittels der in-situ-Hybridisierung wurde eine Detektion von morbillivirusspezifischer mRNS mittels Digoxigenin-markierter Sonden durchgeführt. Die zerebralen Veränderungen der an Polioenzephalitis erkrankten Seehunde wurden anhand histologischer Kritierien in zwei Läsionstypen eingeteilt. Im Läsionstyp I wurden die Läsionen der grauen Substanz zusammengefasst, die durch eine gliale Aktivierung sowie neuronale Degenerationen und Nekrosen charakterisiert waren. Im Läsionstyp II wurden die Areale der grauen Substanz zusammengefasst, die lymphohistiozytäre perivaskuläre Infiltrate aufwiesen. Die infiltrierenden Leukozyten und glialen Reaktionen bei der Polioenzephalitis der PDV-infizierten Seehunde wurden phänotypisch näher charakterisiert. Mittels Immunhistologie konnte eine überwiegend T-zellvermittelte Immunantwort und eine Akkumulierung von Mikroglia/Makrophagen bei PDV-infizierten Seehunden nachgewiesen werden. Die Aufregulierung von MHC-II-Molekülen auf dem Endothel der Bluthirnschranke sowie auf Gliazellen und Leukozyten im Neuroparenchym stellte ein prominentes Merkmal der PDV-Infektion dar. Eine weitere Folge der viralen Infektion war die Proliferation von GFAP-exprimierenden Astrozyten in Entzündungsherden sowie in angrenzenden nicht-infizierten Arealen der Großhirnrinde. In dieser Studie konnten weiterhin mittels Immunhistologie und in-situ-Hybridisierung die fünf virusspezifischen Proteine (N-, P-, M-, F- und H-Protein) sowie N- und PmRNS in den Gehirnproben der Seehunde detektiert werden. Wie mittels immunhistologischer Doppelmarkierung verifiziert werden konnte, fanden sich die Morbillivirusantigene hauptsächlich in Neuronen, während Astrozyten deutlich seltener infiziert waren. Die intraläsionale Expression der Virusproteine in den untersuchten Seehunden zeigte eine deutliche Abhängigkeit vom Läsionstyp, bzw. der zellulären Entzündungsreaktion im Gehirn. In diesem Zusammenhang konnte eine reduzierte oder sogar fehlende Expression der Hüllproteine (vor allem M- und F-Proteine) in Herden mit ausgeprägter lymphohistiozytärer Entzündung nachgewiesen werden. Weiterhin konnte mittels in-situ-Hybridisierung und Immunhistologie eine im Vergleich zur korrespondierenden mRNS reduzierte Menge des viralen P-Proteins in infizierten Bezirken der grauen Substanz der Seehunde beobachtet werden. Die vorliegende Studie zeigt Ähnlichkeiten zwischen PDV-induzierten Läsionen im ZNS der untersuchten Seehunde und Veränderungen bei der Staupevirus-bedingten Polioenzephalitis des Hundes sowie der Masernvirus-induzierten Einschlusskörperchenenzephalitis des Menschen. Die Bedeutung der verminderten Detektion der viralen Proteine im Sinne einer restriktiven Virusproteinexpression als möglicher Mechanismus der viralen Persistenz muss in weiteren Studien untersucht werden.

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Stimmer, Lev: Virusproteinexpression und Phänotypisierung der Immunantwort im zentralen Nervensystem von Seehundstaupevirusinfizierten Seehunden (Phoca vitulina). Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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