Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Density gradient centrifugation of stallion semen

Stuhtmann, Gesa

The objective of the two present studies was to evaluate in-vitro semen quality parameters after density gradient centrifugation of fresh, cooled-stored and frozen-thawed semen. The parameters assessed were motility characteristics assessed by CASA (SpermVisionTM), membrane integrity, acrosome membrane integrity and chromatin structure measured by flow cytometry. Examination of morphological parameters was included in the second study. The solutions EquiPureTM Pro and iodixanol were tested for density gradient centrifugation. In the first study, the first experiment investigated sperm quality parameters of samples after EquiPureTMPro gradient centrifugation (EPP, 330 x g, 15 min), cushion centrifugation (CC, 1000 x g, 20 min), centrifugation without sperm selective medium (WSSM, 330 x g, 15 min), and diluted semen (DS, INRA 82, 25 x 106 sperm/ml). The second experiment evaluated the influence of varying proportions of freezing extender (INRA 82 containing 5 % egg yolk and 2.5 % glycerol) on the quality of frozen-thawed of EquiPureTM Pro treated semen. In the first study, the recovery rate for EPP (26.6 %) was significantly lower than for CC (95.5%) and WSSM (74.0%, p≤0.05). For EPP treated fresh semen, progressive motility, membrane integrity, acrosome membrane integrity and chromatin structure were significantly improved compared to DS, CC and WSSM (p≤0.05). The same observation could be made for cooled-stored semen. For post–thaw spermatozoa treated by EPP, better values for chromatin structure were seen compared to CC and WSSM (p≤0.05). In the second experiment (first study), better progressive motility and membrane integrity (p≤0.05), acrosome membrane integrity and chromatin structure (p≥0.05) were seen for spermatozoa diluted in higher ratios of freezing extender. The second study tested the effect of iodixanol density gradient centrifugation (IODIX, 1000 x g, 20 min), routine centrifugation (CENTR, 600 x g, 10 min) and extended semen (EXTEN, EquiProTM, 50 x 106 sperms/ml) on semen quality parameters. The frozen-thawed trial included stallions to be known as „good freezers“ and „poor freezers“. The yield of spermatozoa was 33.1 % for IODIX and 74.4 % for the CENTR method (p≤0.05). Membrane integrity, acrosome membrane integrity, chromatin structure and percentage of abnormal acrosomal region were better after IODIX treatment compared to EXTEN and CENTR prepared spermatozoa (p≤0.05, fresh semen). For motility parameters and other morphology parameters (total morphological abnormalities, abnormal heads, abnormal neck region, abnormal mid-piece, abnormal principal/end piece) no differences were found for any of the methods IODIX, CENTR or EXTEN (p≥0.05). The IODIX treatment prolonged the longevity of the separated spermatozoa during cooled storage compared to CENTR and EXTEN. After 72 h of storage, there were significant differences for the progressive motility, membrane integrity and acrosome membrane integrity (p≤0.05). Post-thaw spermatozoa showed significantly better progressive motility, membrane integrity, acrosome membrane integrity, chromatin structure and percentage of abnormal acrosomal region for IODIX treatment compared to the CENTR method (p≤0.05). Within the „poor freezers“ group IODIX treated semen showed better membrane integrity, acrosome status, chromatin structure, abnormal acrosomal regions after thawing than semen prepared by CENTR. In summary, the EPP and IODIX preparations selected spermatozoa of better quality than DS, CC, WSSM, CENTR and EXTEN treated semen. Under various storage conditions the density gradient selected spermatozoa showed better results than non-selected spermatozoa (DS, CC, WSSM, EXTEN and CENTR).

Das Ziel der beiden vorliegenden Studien war die Untersuchung der Spermaqualität von Frisch-, Versand- und Tiefgefriersamen nach der Aufbereitung durch Zweischichtendichtezentrifugation. Als Dichtezentrifugationslösungen wurden EquiPureTMPro und Iodixanol hinsichtlich ihres Einflusses auf die mittels CASA(SpermVisionTM) analysierte Spermienmotilität, auf die Spermienmorphologie (Versuch 2) sowie durchflusszytometrisch ermittelte Plasmamembranintegrität, den akrosomalen Status und die Chromatinintegrität (SCSA-assay) untersucht. In der ersten Studie wurden die Spermienqualitätsparameter nach Dichtezentrifugation mit EquiPureTMPro (EPP, 330 x g, 15 min), Zentrifugation ohne Dichtezentrifugationslösung (WSSM, 330 x g, 15 min), „Kissenzentrifugationstechnik“ (CC, 1000 x g, 20 min) und von verdünntem Sperma (DS, INRA 82, 25 x 106 Spermien/ml) miteinander verglichen sowie der Einfluss variierender Volumenanteile des Tiefgefrierverdünners (INRA 82 mit 5 % Eigelb und 2,5 % Glycerin) auf die Samenqualität der EPP zentrifugierten Spermien untersucht. Im ersten Versuchsteil war die Spermienrückgewinnungsrate nach der EPP Zentrifugation (26,6 %) niedriger als nach CC (95,5%) und WSSM (74,0%) (p≤0,05). Frischsamenproben, die durch EPP Zentrifugation aufbereitet wurden, zeigten im Vergleich zu DS, CC und WSSM aufbereiteten Samenproben eine Verbesserung der Spermaqualität in Hinblick auf  Vorwärtsbeweglichkeit, Plasmamembranintegrität, akrosomalen Status sowie Chromatinintegrität (p≤0,05). Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Untersuchung gekühlt gelagerten Samens über eine Lagerungszeit von 72 h (5°C) festgestellt. Bei der Analyse des aufgetauten Tiefgefrierspermas, welches vor der Samentiefgefrierung mit EPP zentrifugiert wurde, konnte eine höhere Chromatinintegrität im Vergleich zu mit CC und WSSM aufbereiteten Samens ermittelt werden (p≤0,05). Im zweiten Teil der ersten Studie wurde ein positiver Einfluss der Zugabe höherer Verdünneranteile auf die Vorwärtsbeweglichkeit und die Plasmamembranintegrität (p≤0,05), sowie auf den akrosomalen Status und die Chromatinintegrität der Spermien (p≥0,05) festgestellt. In der zweiten Studie wurde der Einfluss der Dichtezentrifugation mit Iodixanol (IODIX, 1000 x g, 20 min) auf die Spermaqualität mit derjenigen nach Aufbereitung durch die routinemäßig eingesetzte Zentrifugationsverfahren (CENTR, 600 x g, 10 min) und der Verdünnung von Spermien (EXTEN, EquiProTM, 50 x 106 Spermien/ml) verglichen. Die eingesetzten Hengste konnten aufgrund ihres vorhergehenden Einsatzes in einem kommerziellen Samentiefgefrierprogramms in Gruppen mit guten (durchschnittlicher Anteil von progressive vorwärtbeweglichen Spermien nach dem Auftauen > 35%) oder schlechten Samentiefgefriereigenschaft (durchschnittlicher Anteil von progressive vorwärtbeweglichen Spermien nach dem Auftauen von < 35%) zugeordnet werden. Nach der IODIX Zentrifugation wurde eine Spermienrückgewinnungsrate von 33,1 % und nach der CENTR Zentrifugtion von 74,4 % ermittelt (p≤0,05). Nach IODIX Zentrifugation wurde im Vergleich zu den herkömmlichen Samenaufbereitungsmethoden EXTEN und CENTR eine Verbesserung der Spermaqualität im Hinblick auf die Plasmamembranintegrität, den akrosomalen Status, die Chromatinintegrität sowie den Anteil an Spermien mit abgelöstem Akrosom ermittelt (p≤0.05). Ebenso konnte ein positiver Einfluss der IODIX Zentrifugation auf die Samenqualität nach 72-stündiger, gekühlter Lagerung bei +5°C hinsichtlich der Vorwärtsbeweglichkeit, der Plasmamembranintegrität und des akrosomalen Status festgestellt werden (p≤0.05). Desweiteren wurde nach dem Auftauen von Tiefgefriersamenproben eine Verbesserung der Plasmamembranintegrität, des akrosomalen Status, der Chromatinintegrität sowie des Anteils an Spermien mit abgelöstem Akrosom durch IODIX Zentrifugation ermittelt werden (p≤0.05), wobei insbesondere Samen von Hengsten mit schlechten Tiefgefriereigenschaften ein positiver Einfluss der IODIX Zentrifugation im Vergleich zu herkömmlichen Zentrifugationsverfahren CENTR beobachtet wurde. Zusammenfassend führte die Dichtezentrifugation mit IODIX und EPP, die mit einer reduzierten Spermienrückgewinnungsrate einhergeht, zu einer Verbesserung der Spermaqualität im Vergleich zu den Aufbereitungsverfahren DS, CC, WSSM, CENTR und EXTEN. Die durch IODIX und EPP selektierten Spermien wiesen sowohl am Tag der  Samengewinnung, als auch nach 72-stündiger Lagerung bei +5°C und nach Spermatiefgefrierung eine Verbesserung in standardspermatologisch und durchflusszytometrisch ermittelten Spermienqualitätsparametern auf.

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Stuhtmann, Gesa: Density gradient centrifugation of stallion semen. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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