Kulturelle sowie 16S rDNA basierte Untersuchungen der aeroben und anaeroben Keimflora des equinen Uterus

Täte, Mareike

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Kulturelle sowie 16S rDNA basierte Untersuchungen der aeroben und anaeroben Keimflora des equinen Uterus

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Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den equinen Uterus von Fohlen und gesunden adulten Stuten auf das Vorkommen einer physiologischen bakteriellen Besiedlung zu untersuchen. Des Weiteren wurde das bakterielle Keimspektrum anamnestisch sowie klinisch auffälliger Stuten analysiert und die apathogenen sowie anaeroben Bakterien des equinen Uterus näher bestimmt. Um aussagekräftige bakteriologische Ergebnisse zu gewährleisten, wurde der Vorgang der Probenentnahme und Probenverarbeitung auf mögliche Kontaminationsquellen geprüft. Sowohl bei der Prüfung der Sterilität der Uteruskulturtupfer als auch bei der Überführung des Tupfers in das Transportmedium und dem anschließenden Transport konnten keine Kontaminationsquellen aufgezeigt werden. Zusätzlich wurde die manuelle transvaginale Entnahmetechnik mit der Entnahme mit Spekulum und Zervixfasszange unter Verwendung von doppelt geschützten Tupfern miteinander verglichen. Bei der manuellen transvaginalen Entnahme konnten signifikant häufiger (p < 0,0001) Bakterien nachgewiesen werden als bei der Entnahme mit Spekulum und Zervixfasszange. Auch bei doppelt geschützten Uteruskulturtupfern ist demnach die Probenentnahme mit Hilfe eines Spekulums und einer Zervixfasszange angezeigt, um Kontaminationen zu vermeiden. Von 16 Fohlen, 17 zwei- und dreijährigen Maidenstuten, 15 güsten Stuten, 14 umrossenden Stuten, 11 Stuten, die resorbiert haben, sowie 15 klinisch auffälligen Stuten wurden Uterustupferproben auf aerobe, mikroaerophile und anaerobe Bakterien untersucht. Die parallele Entnahme und Bewertung einer zytologischen Probe erlaubte die sichere Feststellung eines reaktionsfreien bzw. entzündlichen Endometriums. Von den apathogenen sowie anaeroben Bakterien, die in der Mikrobiologie nicht identifiziert wurden, erfolgte eine 16S rDNA basierte molekularbiologische Untersuchung. Die Bakterien, die auch über ihre 16S rDNA Sequenz nicht bestimmt werden konnten, wurden taxonomisch durch die Erstellung eines phylogenetischen Baumes eingeordnet. Während bei den Maidenstuten nur in 11,8 % der Proben Bakterien nachgewiesen werden konnten, waren bei den Fohlen 62,5 % der bakteriologischen Untersuchungen positiv. Diese Ergebnisse und die zugleich stets negative zytologische Untersuchung führen zu der Annahme, dass der Uterus von Fohlen eine permanente physiologische Mischflora aus aeroben und anaeroben Bakterien aufweisen kann. Bei gesunden adulten Stuten konnten keine neuen Erkenntnisse bezüglich des Vorkommens einer physiologischen Keimflora gewonnen werden. Die Gruppen der anamnestisch auffälligen Stuten wiesen in 13,3 % bis 36,4 % der Fälle einen positiven bakteriologischen Befund auf und lediglich in 2 Proben konnten vermehrt neutrophile Granulozyten nachgewiesen werden. Bei den klinisch auffälligen Stuten erfolgte aus jeder Probe ein Bakteriennachweis und 37,5 % der zytologischen Untersuchungen waren positiv. Erwartungsgemäß wurden in dieser Gruppe signifikant häufiger fakultativ pathogene Bakterien ohne apathogene Begleitflora nachgewiesen als in den anderen Versuchsgruppen. Die am häufigsten nachgewiesenen fakultativ pathogenen Bakterien waren, mit den Angaben in der Literatur übereinstimmend, die β-hämolysierenden Streptokokken. Die zehnmal nachgewiesenen anaeroben Bakterien stammten alle von den Tupfern der Fohlen und der Maidenstuten. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Studie sind anaerobe Bakterien also weder bei anamnestisch noch bei klinisch auffälligen Stuten von Bedeutung. Bei den molekularbiologisch untersuchten Bakterien handelte es sich um ubiquitär vorkommende Bakterien, die zum Teil im Rahmen opportunistischer Infektionen erwähnt werden und häufig ein Bestandteil der Normalflora beim Menschen oder beim Tier sind. Mit der vorliegenden Arbeit wurde außerdem erstmalig ein Datensatz mit partiellen 16S rDNA Sequenzen equiner uteriner Bakterien aufgebaut.

The aim of the present work was to examine the equine uterus of foals and healthy adult mares with regard to the existence of a physiological bacterial colony. A further aim was to analyse the range of bacterial germs in mares with a history of fertility problems or with clinical evidence of endometritis. In order to ensure meaningful bacteriological results the process of sample taking and sample processing was checked for potential contamination sources. Neither the sterility control of the endometrial swab nor the transfer of the swab into the transport medium and the subsequent transportation was able to disclose any contamination sources. In addition a comparison was made between the manual transvaginal sampling technique and the sampling with speculum and cervical forceps using double-guarded uterine swabs. With manual transvaginal sampling bacteria were identified significantly more often (p < 0.0001) than with sampling using speculum and cervical forceps. So even with double-guarded endometrial swabs it is advisable to sample using speculum and cervical forceps in order to avoid contamination. Endometrial swab samples of 16 foals, 17 two- or three-year-old maiden mares, 15 barren mares, 14 repeat-breeding mares, 11 mares that have resorbed as well as 15 mares with clinical evidence of endometritis were examined for aerobic, microaerophilic and anaerobic bacteria. Parallel sampling and assessment of a cytological smear allowed to safely conclude whether the endometrium was reaction-free or inflammatory. The apathogenic as well as the anaerobic bacteria that remained unidentified by microbiology underwent a 16S rDNA-based examination with molecular biology methods. The bacteria that could not be identified even by using their 16S rDNA sequence were classified taxonomically by creating a phylogenetic tree. While in the case of maiden mares bacteria were identified in only 11.8% of the samples, 62.5% of the bacteriologies of the foals were positive. These results along with the always negative cytology lead to the assumption that the uterus of foals may show a permanently physiological flora of a mix of aerobic and anaerobic bacteria. In the case of healthy adult mares no new knowledge was gained in terms of the existence of a physiological bacterial flora. In 13.3% to 36.4% of the cases, the groups of mares with a history of fertility problems showed a positive bacteriology and only 2 samples showed an increase of neutrophile granulocytes. For the mares with clinical evidence of endometritis bacteria were detected in every sample and 37.5% of the cytologies were positive. As was expected this group showed significantly more facultatively pathogenic bacteria without an accompanying apathogenic flora than did the other trial groups. The facultatively pathogenic bacteria that were detected the most often were, in accordance with information from the literature, β-haemolysing streptococci. The anaerobic bacteria that were detected ten times all originated from the swabs of the foals and maiden mares. According to the results of this study anaerobic bacteria are of no importance for either mares with a history of fertility problems or those with clinical evidence of endometritis. The bacteria examined with molecular biology methods were ubiquitously existing bacteria, some of which are mentioned in connection with opportunistic infections and are often part of the normal flora in humans or animals. This work also serves to establish for the first time a dataset with partial 16S rDNA sequences of equine uterine bacteria.