Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Die Abhängigkeit der Steroidhormonsynthese in porzinen Kumuluszellen von der MAPK (mitogen activated protein kinase) und dem BMP6 (bone morphogenetic protein 6)

Töpfer, Dagmar

Steroid hormones in the follicle are essential for follicular development and successful fertilization. One of the most important signal transduction pathways during oocyte maturation is the MAPK cascade (mitogen-activated protein kinase). Therefore, the influence of MAPK inhibition on steroid hormone synthesis in cumulus cells during in vitro maturation (IVM) was examined. Porcine cumulus oocyte complexes were isolated from ovaries of slaughtered pigs and matured in vitro with and without the MAPK inhibitor U0126 for various periods. To characterise the hormone secretion of the cumulus cells, the concentrations of 17ß-estradiol (E2) and progesterone (P4) were determined by radioimmunoassays. In addition, the mRNA expression of selected steroidogenic enzymes were analysed by RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction). Furthermore, MAPK activation was examined using an immunoblot. During the overall culture period, U0126 caused a complete inhibition of nuclear maturation as well as no cumulus expansion occurred. Under the influence of the inhibitor the P4 secretion was nearly completely inhibited and the E2 secretion increased progressively until the end of IVM. The transport of cholesterol to the inner mitochondrial membrane and the following synthesis of pregnenolone is not affected by the MAPK inhibition, because the expression of StAR (steroidogenic acute regulatory protein) and CYP11A1 (side-chain cleavage enzyme) showed no differences. However, MAPK inhibition increased the mRNA levels of CYP19A1 (cytochrome P450 aromatase) and reduced the mRNA expression of 3ß-HSD (3ß-hydroxysteroid-dehydrogenase). It could be hypothesized that MAPK activation participates in the physiological alteration from initial E2 synthesis to dominant P4 production of porcine cumulus cells. Oocyte secreted factors (OSFs) are involved in important cellular processes in the follicle. Bone morphogenetic protein 6 (BMP6) seems to be one of these factors. The effect of BMP6 has been examined only in granulosa cell cultures and there BMP6 prevents progesterone dominance similar as MAPK inhibition. Therefore, in the present study the role of BMP6 as a potential OSF on steroidogenesis in cumulus cells was analysed. Expression of BMP6-mRNA could be demonstrated in oocytes and cumulus cells at all sampling times. The nuclear maturation of oocytes and the cumulus cell expansion showed no changes after BMP6 was added to the medium. The hormone analysis and RT-PCR results of steroid enzymes did not change under the influence of BMP6 as well. The MAPK activity in cumulus cells was also not affected. In the present study, BMP6 supplementation did not caused effects like described in granulosa cell cultures. This seems to be depended on the different degrees of luteinisation. In granulosa cell cultures, the cells synthesise considerably more progesterone than cumulus cells during IVM of cumulus oocyte complexes. Nevertheless, BMP6 is still a possible oocyte secreted factor, which is not mediated by the MAPK cascade in porcine cumulus cells. The question of an antiluteal effect of BMP6 could not yet be answered, but the results of this study lead to new investigations. Moreover, the functions and regulations of OSFs need to be examined more intensively.

Steroidhormone im Follikel sind essentiell für die optimale Entwicklung von befruchtungsfähigen Eizellen. Einen der wichtigsten Signaltransduktionswege während der Eizellreifung stellt die MAPK-Kaskade (mitogen-activated protein kinase-Kaskade) dar. In der vorliegenden In-vitro-Studie wurde untersucht, welchen Einfluss die MAPK auf die Steroidhormonsynthese in porzinen Kumuluszellen hat. Dafür wurden Kumulus-Oozyten-Komplexe aus Ovarien von Schlachtschweinen isoliert und über verschiedene Zeiträume in einem Basismedium kultiviert. Um die sezernierten Steroidhormone quantitativ zu charakterisieren, wurden mittels Radioimmunoassay die 17ß-Estradiol (E2)- und Progesteron (P4)-Konzentrationen ermittelt. Neben diesen beiden Steroidhormonen erfolgte die Analyse der mRNA-Expressionsmuster ausgewählter Enzyme des Steroidhormon-Biosynthesewegs in den Kumuluszellen mit Hilfe der RT-PCR (Reverse Transkriptase-polymerase chain reaction). Mittels Immunoblot wurde der Phosphorylierungsgrad der MAPK in den Kumuluszellen untersucht. Um den Einfluss der MAPK auf die Steroidhormonsynthese zu charakterisieren, wurde dem Basismedium der MEK-Inhibitor U0126 zugefügt und dadurch die Aktivierung der MAPK verhindert. Dadurch konnte zunächst die Hemmung der Wiederaufnahme der Meiose in den Oozyten und das Ausbleiben der Expansion des cumulus oophorus gezeigt und damit frühere Experimentalstudien reproduziert werden. Die Hormonanalysen nach der Hemmung der MAPK zeigten eine deutliche P4-Hemmung mit einhergehender gesteigerter E2-Sekretion am Ende der IVM nach 46 h. Der Transport von Cholesterin zur inneren Mitochochondrien-membran und die folgende Synthese zu Pregnenolon wird vermutlich nicht von der MAPK beeinflusst, da das Expressionverhalten von StAR (steroidogenic acute regulatory protein) und CYP11A1 (P450scc oder side chain cleavage-enzyme) keine Veränderungen aufwies. Vielmehr konnte gezeigt werden, dass die MAPK wesentlich an der Steigerung der CYP19A1 (Cytochrom P450-Aromatase)- und Reduktion der 3ß-HSD (3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase)-Expression regulatorisch beteiligt ist und auf diesem Weg den Wechsel von der Östradiol- zur Progesterondominanz steuert. Von der Eizelle sezernierte Faktoren (oocyte secreted factors, OSFs) sind an wichtigen zellulären Prozessen im Follikel beteiligt. Unter anderem wurde von einem OSF, dem BMP6 (bone morphogenetic protein 6), die mögliche luteinisierungshemmende Wirkung, ähnlich wie die der deaktivierten MAPK, postuliert. Bisherige Untersuchungen wurden überwiegend mit Granulosazellkulturen durchgeführt. Daher wurde in der vorliegenden Studie analysiert, ob durch zugeführtes BMP6 ein Einfluss auf die Steroidhormongenese in Kumuluszellen hervorgerufen werden kann. Gleichzeitig wurde anhand des Phosphorylierungsgrades untersucht, ob die BMP6-Aktivität über den MAPK-Signalweg vermittelt wird. Die mRNA von BMP6 konnte sowohl in Oozyten, als auch in Kumuluszellen nachgewiesen werden. Die Kernreifung der Eizellen und die Kumuluszellexpansion zeigten durch die Zugabe von BMP6 zum Maturationsmedium keine Veränderungen. Die Hormonanalysen und RT-PCR-Ergebnisse der steroidalen Enzyme ließen gleichermaßen erkennen, dass mit dem vorliegenden Versuchsdesign ein BMP6-Einfluss ausblieb. Die MAPK-Aktivität in den Kumuluszellen wurde ebenfalls nicht beeinflusst. BMP6 kommt nach wie vor als potentieller OSF in Frage, wobei die Aktiviät dieses Proteins in porzinen Kumuluszellen MAPK-unabhängig reguliert zu sein scheint. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bieten vielfältige Untersuchungsansätze, da die Frage nach einer möglichen luteinisierungshemmenden Wirkung noch nicht abschließend beantwortet werden kann. Hinzu kommt, dass trotz zahlreicher Resultate aus Studien über OSFs die Funktionen und Regulationsmechanismen nach wie vor unklar sind und weiteren Forschungsbedarf darstellen.

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Töpfer, Dagmar: Die Abhängigkeit der Steroidhormonsynthese in porzinen Kumuluszellen von der MAPK (mitogen activated protein kinase) und dem BMP6 (bone morphogenetic protein 6). Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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