Die Abhängigkeit der Steroidhormonsynthese in porzinen Kumuluszellen von der MAPK (mitogen activated protein kinase) und dem BMP6 (bone morphogenetic protein 6)

Steroidhormone im Follikel sind essentiell für die optimale Entwicklung von befruchtungsfähigen Eizellen. Einen der wichtigsten Signaltransduktionswege während der Eizellreifung stellt die MAPK-Kaskade (mitogen-activated protein kinase-Kaskade) dar. In der vorliegenden In-vitro-Studie wurde untersucht, welchen Einfluss die MAPK auf die Steroidhormonsynthese in porzinen Kumuluszellen hat. Dafür wurden Kumulus-Oozyten-Komplexe aus Ovarien von Schlachtschweinen isoliert und über verschiedene Zeiträume in einem Basismedium kultiviert. Um die sezernierten Steroidhormone quantitativ zu charakterisieren, wurden mittels Radioimmunoassay die 17ß-Estradiol (E2)- und Progesteron (P4)-Konzentrationen ermittelt. Neben diesen beiden Steroidhormonen erfolgte die Analyse der mRNA-Expressionsmuster ausgewählter Enzyme des Steroidhormon-Biosynthesewegs in den Kumuluszellen mit Hilfe der RT-PCR (Reverse Transkriptase-polymerase chain reaction). Mittels Immunoblot wurde der Phosphorylierungsgrad der MAPK in den Kumuluszellen untersucht. Um den Einfluss der MAPK auf die Steroidhormonsynthese zu charakterisieren, wurde dem Basismedium der MEK-Inhibitor U0126 zugefügt und dadurch die Aktivierung der MAPK verhindert. Dadurch konnte zunächst die Hemmung der Wiederaufnahme der Meiose in den Oozyten und das Ausbleiben der Expansion des cumulus oophorus gezeigt und damit frühere Experimentalstudien reproduziert werden. Die Hormonanalysen nach der Hemmung der MAPK zeigten eine deutliche P4-Hemmung mit einhergehender gesteigerter E2-Sekretion am Ende der IVM nach 46 h. Der Transport von Cholesterin zur inneren Mitochochondrien-membran und die folgende Synthese zu Pregnenolon wird vermutlich nicht von der MAPK beeinflusst, da das Expressionverhalten von StAR (steroidogenic acute regulatory protein) und CYP11A1 (P450scc oder side chain cleavage-enzyme) keine Veränderungen aufwies. Vielmehr konnte gezeigt werden, dass die MAPK wesentlich an der Steigerung der CYP19A1 (Cytochrom P450-Aromatase)- und Reduktion der 3ß-HSD (3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase)-Expression regulatorisch beteiligt ist und auf diesem Weg den Wechsel von der Östradiol- zur Progesterondominanz steuert. Von der Eizelle sezernierte Faktoren (oocyte secreted factors, OSFs) sind an wichtigen zellulären Prozessen im Follikel beteiligt. Unter anderem wurde von einem OSF, dem BMP6 (bone morphogenetic protein 6), die mögliche luteinisierungshemmende Wirkung, ähnlich wie die der deaktivierten MAPK, postuliert. Bisherige Untersuchungen wurden überwiegend mit Granulosazellkulturen durchgeführt. Daher wurde in der vorliegenden Studie analysiert, ob durch zugeführtes BMP6 ein Einfluss auf die Steroidhormongenese in Kumuluszellen hervorgerufen werden kann. Gleichzeitig wurde anhand des Phosphorylierungsgrades untersucht, ob die BMP6-Aktivität über den MAPK-Signalweg vermittelt wird. Die mRNA von BMP6 konnte sowohl in Oozyten, als auch in Kumuluszellen nachgewiesen werden. Die Kernreifung der Eizellen und die Kumuluszellexpansion zeigten durch die Zugabe von BMP6 zum Maturationsmedium keine Veränderungen. Die Hormonanalysen und RT-PCR-Ergebnisse der steroidalen Enzyme ließen gleichermaßen erkennen, dass mit dem vorliegenden Versuchsdesign ein BMP6-Einfluss ausblieb. Die MAPK-Aktivität in den Kumuluszellen wurde ebenfalls nicht beeinflusst. BMP6 kommt nach wie vor als potentieller OSF in Frage, wobei die Aktiviät dieses Proteins in porzinen Kumuluszellen MAPK-unabhängig reguliert zu sein scheint. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bieten vielfältige Untersuchungsansätze, da die Frage nach einer möglichen luteinisierungshemmenden Wirkung noch nicht abschließend beantwortet werden kann. Hinzu kommt, dass trotz zahlreicher Resultate aus Studien über OSFs die Funktionen und Regulationsmechanismen nach wie vor unklar sind und weiteren Forschungsbedarf darstellen.