Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Organkultur von Jejunalsegmenten zur Verwendung als dreidimensionales Darmtestsystem

Tordy, Dominique Maria

All mammals depend on the nutrient uptake via their gastro-intestinal apparatus. Most nutrients are resorbed in the jejunum, the longest and middle part of the small intestine. The monolayer made of enterocytes is the most important barrier between the intestinal content and the circulating blood. These cells control the crossover of substances, which can be para- or transcellular, active or passive. The mechanisms of intestinal barrier passage have not been researched in detail so far. This concerns nutrients, new ones and already prescribed drugs and at present frequently discussed "functional foodsubstances. There are various approaches to carry out research on those procedures. It is a challenge to create a testing system, which is both simple and ethically acceptable, and able to represent complex processes taking place at the native intestinal barrier. Cell culture testing systems have the most simple experimental set-up. So far enterocytes have not been cultivated successfully in vitro. Thus, alternative cell lines have been used, which share certain, especially resorptive characteristics with native enterocytes, but proliferate in vitro. Last year cells with enterocyte characteristics could be differenciated from human pluripotential stem cells [Spence et al. (2010)].With the main focus on financial, man power and logistic aspects, they are predestined for high turnover testings. But due to the differences between enterocytes and cell lines and also because of the missing parts of the cell population and the missing cell-cell-communications in the jejunal wall, those systems are not able to imitate the situation at the native intestinal wall. Thus, in vitro testing systems were developed that include the whole jejuna wall. In the Ussing chamber, segments of the jejunal wall, including or excluding the serosa, are placed between the chamber compartiments and substance crossover from the luminal to the serosal site is measured. The Everted gut sac technique describes an everted jejunal segment, which is ligated and put into medium position. This way, two "chambersäre formed. Changes in the concentration of testing substances in the two segments give evidence of resorptive processes at the intestinal barrier. These testing systems include influences of the whole intestinal wall. However, there is a difference between the passage of the intestinal barrier and substance crossover through the whole jejunal wall. Other in-situ- and in-vivo-testing set-ups include the whole jejunal wall, but only examine substance passage through the intestinal barrier. The former one describes testings on living, but anesthetized animals. One jejunal segment is isolated while its vessels are conserved and keep up the contact to the animal’s blood circle. Medium with testing substance is taken in and intestinal uptake is estimated by the measuring of the differences between concentrations in venous outflowing blood and in the medium before and after the experiment. In-vivo-studies include oral application of testing substances and the analysis of samples of blood, urine, feces and samples of tissue taken postmortem. These testing systems depend on high financial and logistical effort and in-situtestings also demand skillful staff. Thus, they are not useful for high turnover testings. But they offer a good chance to show processes at the intestinal barrier, isolated from metabolic influences. The present studies aimed at the in vitro obtainment of a complete jejuna segment, including blood vessels, which can be used as an in vitro intestinal testing system. This should combine the complexity of the established and recently described in vivo testing systems with the advantages of in vitro testing systems. Moreover a species-independent method is aspired. Techniques for the explantation of jejunal segments of pigs and rats could be developed and optimized. Their vessels were catheterized and also preserved. Thus, it was possible to feed the jejunal segments during culture period. Afterwards, the jejunal segments were cultivated in a dynamic bioreactor system. Nutrients and oxygen were delivered by a special medium, which was pumped into the artery of the segment in a pulsatile way. After the outflow through the vein, it was lead back into the circular flow. Due to the coculture of the different cell types of the jejunum and the resulting cell-cellcommunication, there was no need to supplement the medium with special growth factors that are commonly used in the culturing of cells, similar to enterocytes. Only FCS containing unspecific growth factors was used. Accordingly, there is no need for species specific contents in the medium. Additionally, parameters for monitoring the culture were studied. First hints on the success of the culture were given by the movement of the jejunum cultured from the pig and a positive MTT-testing of the jejunum cultured from the rat. The latter one changed to a deep blue color after incubating with the testing substance. After the culturing period, the jejunal segments were stained histologically and immunohistologically using labeled antibodies. The preparations were studied microscopically and compared to preparations of the native jejunal wall of both species. H.E.-staining gave an overview and showed the obtainment of the different layers and morphologic cell characteristics. The cell density was lower than in native jejunal preparations. There was no endothelial inner coating in the veins of cultivated rat jejunum. The obtaining of cell division ability was proven by staining with PCNA (rat) and Ki67 (pig). Immunohistological staining with antibodies against CKAE and E-cadherin revealed the epithelial origin of the luminal cell layer and proved typical cell-cell-connections, the adherens junctions. Alcian blue staining displayed the obtaining of Goblet cells in the tunica mucosa of cultivated porcine jejunal segments. In cultured intestinal segments of both species, flat cells could be shown that built a layer luminal in the vessels. They were missing in the rat veins. In the segments of this species, Flk-1-receptors as endothelial cell markers were detected. The used antibodies were not cross reactive with the pig’s tissue. In the tunica muscularis and in the artery wall of all cultured segment, smooth muscle cells could be shown by staining with SMA-antibodies. Staining against PGP proved neural structures in the cultured intestine, which fitted the native structures in position and size. Twelve jejunal segments explanted from pigs and rats were cultured for six to ten days. Afterwards it could be shown that there had been regeneration processes. The number of cells was reduced in comparison with the jejunal segment. But with focus on localization, morphological and immunhistological characteristics, cells fitted with enterocytes, endothelial cells, muscle and neural cells of native jejunum. Goblet cells were detected in cultivated porcine jejunum. In future, the focus will be on the optimization of explantation and culturing techniques. Studies of resorptive characteristics of different substances should follow to compare the results to those of other testing systems. This way, the in vitro cultivated jejunal segment should be established as a new testing system for resorption processes. Eventually, later it could become possible to obtain jejunal segments for transplantations.

Jedes Wirbeltier ist auf die Nährstoffaufnahme durch den Magen-Darm-Trakt angewiesen. Die meisten Nährstoffe gehen beim monogastrischen Säugetier im Jejunum, dem mittleren und längsten Teilsegment des Dünndarms durch Resorption in den Blutkreislauf über. Die wichtigste Grenze für diesen Übergang wird durch einen Monolayer aus Enterozyten gebildet. Er kann para-oder transzellulär, aktiv oder passiv stattfinden und wird durch die Enterozyten kontrolliert. Die Mechanismen für die Passage der Blut-Darm-Schranke sind noch nicht zu genüge erforscht. Dies bezieht sich auf Nährstoffe, neue und auch bereits eingesetzte Arzneimittel sowie auf das derzeit viel diskutierte „Functional food“. Zur Erforschung dieser Vorgänge gibt es bereits verschiedene Ansätze. Die Herausforderung liegt darin, ein möglichst einfaches und ethisch vertretbares System zu entwickeln, welches die komplexen Vorgänge an der Jejunalwand möglichst exakt abbildet. Die Systeme mit dem einfachsten Aufbau beruhen auf Zellkulturen. Da sich Enterozyten bisher nicht in vitro anzüchten ließen, wurde für die Zellkultur auf Zellen aus Zelllinien zurückgegriffen, die bestimmte, unter anderem resorptive Eigenschaften mit den Enterozyten teilen, sich jedoch in vitro kultivieren lassen. Im letzten Jahr konnten aus pluripotenten humanen Stammzellen Zellen mit Eigenschaften reifer Enterozyten differenziert werden [Spence u. a. (2010)]. Diese Systeme sind auch im Hinblick auf den damit verbundenen geringen finanziellen, personellen und logistischen Aufwand für hohe Hochdurchsatztestungen geeignet, können aber die Resorption an der Darmwand nicht exakt abbilden, da die Zellen nicht alle Eigenschaften mit nativen Enterozyten teilen und die übrigen Komponenten der Zellpopulation und damit die Zell-Zell-Kommunikation zwischen verschiedenen Zelltypen unbeachtet bleiben. Daher gibt es In-vitro-Testsysteme, die die gesamte Darmwand in die Testungen mit einbeziehen. Für Resorptionsstudien in der Ussing-Kammer werden Stücke von der Jejunalwand mit oder ohne Serosa in eine zweigekammerte Apparatur eingespannt und der Übertritt von Substanzen von der luminalen zur serosalen Seite gemessen. Bei der Everted gut sac-Technik wird ein Jejunalsegment umgestülpt, abgebunden und mittig in eine Flüssigkeitskammer verbracht. So entstehen auch hier zwei Kompartimente. Anhand der Konzentrationsänderungen von Substanzen in diesen „Kammern“ lassen sich die Resorptionseigenschaften des Gewebes einschätzen. Bei diesem Ansatz werden Einflüsse der gesamten Jejunalwand mit einbezogen. Allerdings entsprechen die Passagevorgänge durch die komplette Jejunalwand nicht denen durch den Enterozyten-Monolayer. In anderen Testsystemen wird für den Versuchsaufbau ebenfalls die gesamte Darmwand genutzt, die Testsubstanzen müssen dabei aber dennoch nur die Blut-Darm-Schranke passieren. Dies geschieht sowohl bei In-situ- als auch bei In-vivo-Versuchen. Bei ersteren wird im narkotisierten Versuchstier ein Jejunalabschnitt unter Erhalt der Gefäße isoliert und das Trägermedium wird mit der enthaltenen Testsubstanz in diesen Abschnitt eingebracht. Die Resorptionsrate ist anhand der Veränderung der Substanzkonzentration im Lumen und im venös abfließenden Blut zu untersuchen. Bei Fütterungsversuchen wird die Substanz oral eingegeben und die Resorption sekundär anhand von Blut-, Kot-, Urin- und postmortal entnommenen Proben abgeschätzt. Diese Testsysteme sind nur unter hohem finanziellem und logistischem Aufwand durchzuführen und die In-situ-Testungen verlangen speziell geschultes Personal. Es sind daher keine hohen Durchsatzraten möglich. Vorteilhaft ist die starke Annäherung an die In-vivo-Situation, unabhängig von nicht-intestinalen Stoffwechsel-vorgängen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war der Erhalt eines vollständigen Jejunalsegments einschließlich der Blutgefäße in vitro, das als In-vitro-Darmtestsystem genutzt werden kann. Dies soll die Komplexität der zuletzt genannten etablierten Testsysteme mit den Vorteilen von In-vitro-Testsystemen vereinen. Überdies soll auf diese Weise eine speziesübergreifende Technik geschaffen werden. Es konnten Techniken zur Explantation von Jejunalsegmenten aus Ratte und Schwein entwickelt und optimiert werden. Dabei wurden die Gefäße katheterisiert und erhalten, so dass sie eine Versorgung des Darmsegmentes während der Kultur ermöglichten. Im Anschluss wurden die Jejunalsegmente in einem dynamischen Bioreaktorsystem kultiviert. Dabei erfolgte die Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff über ein speziell entwickeltes Medium. Dieses wurde pulsatil durch die versorgende Arterie in das Segment gepumpt und nach Abfluss durch die Vene wieder in den Kreislauf eingebracht. Da die Zellpopulation der Jejunalwand und somit die Zell-Zell-Kommunikation erhalten blieb, konnte auf spezifische Wachstumsfaktoren aus der herkömmlichen Enterozyten-Ersatzzellenkultur verzichtet werden, der Zusatz von FCS mit enthaltenen, unspezifischen Wachstumsfaktoren genügte. Dies hat den Vorteil, dass speziesspezifische Medienzusätze entfallen. Weiterhin wurden Parameter zur Überwachung der Kultur untersucht. Eine erste Abschätzung des Kulturerfolgs war durch Beobachtung von Eigenbewegungen der porcinen Jejunalsegmente und die Anwendung des MTT-Tests an den Jejunalsegmenten aus der Ratte möglich. Bei einem positiven MTT-Test färbte sich das Jejunalsegment nach Einbringen der Testlösung und einer Inkubationszeit tiefblau. Anschließend an die Kultur wurden die Jejunalsegmente histologisch und immunhistologisch mithilfe markierter Antikörper angefärbt und mikroskopisch mit nativen Jejunalsegmenten der beiden Spezies verglichen. Anhand von Übersichtsfärbungen ließ sich die erhaltene Schichtung der Jejunalwand und die morphologische Ähnlichkeit der Zellen in den Schichten zeigen. Die Zelldichte war geringer als in den Nativpräparaten. In den Venen der kultivierten Jejunalsegmente aus der Ratte fehlte die gefäßauskleidende Endothelzellschicht. Der Erhalt der Teilungsfähigkeit der Zellen konnte mithilfe der Teilungsmarker PCNA (Ratte) und Ki67 (Schwein) nachgewiesen werden. Immunhistologische Färbungen gegen die Markermoleküle CKAE und E-Cadherin zeigten bezogen auf CKAE die epitheliale Herkunft der Zellen, welche die Jejunalwand luminal einschichtig auskleideten, und belegten bezogen auf E-Cadherin typische Zell-Zell-Verbindungen zwischen diesen Zellen, die Adherens junctions. Durch eine Färbung mit Alzianblau konnte im Fall der kultivierten porcinen Jejunalsegmente auch der Erhalt von Becherzellen in der Zellpopulation der Tunica mucosa nachgewiesen werden. Bei Jejunalsegmenten beider Spezies zeigten sich an der Innenwand der Arterien flache Zellen, die morphologisch den Endothelzellen im Nativpräparat entsprachen. Bei den Jejunalsegmenten aus der Ratte fehlten diese in den Venen. Bei dieser Spezies waren Flk-1-Rezeptoren als Endothelzellmarker nachzuweisen. Die Antikörper zeigten sich bei den porcinen Jejunalsegmenten nicht kreuzreaktiv. In der Tunica muscularis und in der Wand der Arterien ließen sich anhand von immunhistologischen Färbungen gegen SMA glatte Muskelzellen nachweisen. Färbungen gegen PGP zeigten bei kultivierten Jejunalsegmenten beider Spezies neuronale Strukturen in der Darmwand, die in Lokalisation und Ausprägung denen im Nativpräparat entsprachen. Zwölf Jejunalsegmente aus Schweinen und Ratten konnten über sechs bis zehn Tage in vitro kultiviert werden. Anschließend konnte gezeigt werden, dass in dem Gewebe Regenerationsvorgänge stattfanden und dass die Zellpopulation nicht in ihrer Anzahl, jedoch in ihrer Zusammensetzung erhalten blieb, da die Zellen entsprechend ihrer Lokalisation morphologische und immunhistologische Eigenschaften von Enterozyten, Endothelzellen, Muskel und Nervenzellen aufwiesen. Überdies ließen sich in den kultivierten porcinen Jejunalsegmenten auch Becherzellen nachweisen. Angestrebt sind nun die Optimierung der Explantations- und Kulturtechniken sowie die Bestimmung der Resorptionsraten verschiedener Substanzen, um diese mit den Ergebnissen aus anderen Testsystemen zu vergleichen und das Jejunalsegment als Testsystem etablieren zu können. Möglicherweise kann später ein Organerhalt zu Transpantationszwecken auf diese Weise ermöglicht werden.

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Tordy, Dominique Maria: Organkultur von Jejunalsegmenten zur Verwendung als dreidimensionales Darmtestsystem. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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