Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Funktionelle Charakterisierung der Mikroglia in Nagermodellen für Hundestaupe und Epilepsie

Wagner, Stefanie

The chronic phase of Theiler’s murine encephalomyelitis is an animal model for canine distemper and MS. After an acute polioencephalitis resistant mice strains eliminate the virus from the CNS, whereas susceptible mice strains exhibit a biphasic course of the disease with persistence of the virus and development of a chronic demyelination. The aim of this study was an immunophenotypic and functional characterisation of microglial cells of two different mice strains to assess their involvement in the pathogenesis of TME and seizures. The immunophenotypic and functional activation of microglia cells of dogs with CDV-infection should be confirmed in this study. Resistant C57BL/6 mice and susceptible SJL/J mice were euthanized and after transcardiac perfusion with PBS the brains were extracted from the mice’s cranium. Brain microglia was isolated from the brains of mice 14 and 99 d.p.i. with TMEV or injection of cell culture supernatant by an initial and a major density gradient centrifugation. Ex vivo immunophenotypical and functional characterization was performed by flow cytometrical analyses. Samples of most animal groups showed a high percentage of ROS-generating microglia cells and an enhanced ROS generation. Infected SJL/J mice 99 d.p.i. showed the highest ROS generation which can be implicated in the pathogenesis of demyelination. An enhanced ROS generation is specific for microglia isolated of dogs with CDV-infection. The mean phagocytosis activity in infected mice 14 and 99 d.p.i. reached higher levels in comparison to the respective non-infected mice. The C57BL/6 mice showed the highest phagocytosis activity which could be indicative of an enhanced elimination of virus. Non-infected control mice exhibited a higher percentage of MHC I+ microglia at both time points as compared to infected mice. The C57BL/6 mice showed the highest expression intensity of MHC I+ 99 d.p.i. which could be indicative of an improved elimination of virus compared to SJL/J-mice. The expression intensity of IL-1ß in infected mice of both strains reached higher levels compared to infected mice of both strains in the late phase and non-infected control mice. At both time points the expression intensity of TNFα was reduced in infected mice as compared to non-infected controls. Therefore, the immunophenotypical and functional activation of microglia cells in dogs with CDV-infection could be confirmed in this animal model. The results of this study give an indication for new therapy strategies for demyelinating diseases such as CDV-infection and MS. The ambiguous features of microglia cells in this model should be considered. Epilepsy is one of the most frequent chronic neurological diseases in cats and dogs. Erythropoietin has neuroprotective, neurotrophic, and anti-inflammatory potential in the CNS but its application is limited due to bone marrow stimulating properties. The frequency and severity of seizures can be reduced by the application of Epo. In second study the effect of EPO and pHBSP, a novel Epo-derived, non-erythropoietic, peptide mimetic, was determined on the immunophenotypical and functional activity of microglial cells in a rat post SE model. Teflon-isolated bipolar stainless steel electrodes were stereotactically implanted into the right anterior basolateral nucleus of the amygdale of female Sprague-Dawley rats to induce a self-sustained status epilepticus electrically. These electrodes were also implanted in control rats that were not stimulated electrically. The animals received an intravenous and a subcutaneous injection of Epo, pHBSP or scrambled peptide immediately following SE. The subcutaneous injection was repeated at day 1 and 3 following SE. After microglial cells of these rats were isolated with gradient centrifugation, their immunophenotypical and functional state was characterized by flow cytometry. Microglial cells were identified by their characteristic immunophenotype of CD18+, CD11b+ and CD45low. Microglial cells were activated post SE and the mean fluorescence intensity of MHC II, B7-2, IL-6 and TNFα was lower in rats post SE treated with pHBSP and Epo in comparison to rats post SE treated with scrambled peptide. The phagocytosis intensity and the ROS generation was reduced in rats treated with Epo and pHBSP in comparison to rats treated with scrambled peptide with and without SE. Treatment with Epo and pHBSP reduced the functional activity of microglial cells in rats post SE. Epo had a more pronounced effect on microglial cells compared to the peptide mimetic. Epo and pHBSP can be considered to have an anti-inflammatory potential in the central nervous system at least on microglia activity. The anti-inflammatory potential of Epo and pHBSP give an indication for new therapy strategies for epilepsy or inflammatory diseases of the CNS that could be examined in the future in a natural animal model such as dogs.

Die chronische Phase der murinen Theilervirus-Enzephalomyelitis ist ein Nagermodell für die kanine Staupe und die MS, bei der resistente Mäusestämme das Virus nach einer akuten Polioenzephalitis eliminieren können, während empfängliche Mäusestämme einen biphasischen Krankheitsverlauf mit chronischer Demyelinisierung im ZNS zeigen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die immunphänotypische und funktionelle Charakterisierung von Mikroglia zweier für das TMEV unterschiedlich empfänglicher Mäusestämme, um die Beteiligung dieser Zellpopulation an der Pathogenese der murinen Theilervirus-Enzephalomyelitis und der damit verbundenen Krampfanfälle zu untersuchen. Die immunphänotypischen und funktionellen Zeichen der Aktivierung der Mikroglia in Hunden mit Staupeinfektion sollten in diesem Nagermodell bestätigt werden. Mikroglia wurden 14 und 99 Tage nach Infektion mit dem TMEV oder nach Injektion von Zellkulturüberstand aus Mäusegehirnen von für das TMEV empfänglicher SJL/J-Mäuse und für das TMEV resistenter C57BL/6-Mäuse nach Perfusion über eine Dichtegradientenzentrifugation isoliert und anschließend immunphänotypisch und funktionell durch ihre Phagozytoseaktivität, als auch ihre ROS-Bildungsintensität durchflusszytometrisch charakterisiert. In Proben der meisten Tiergruppen wurde ein hoher Prozentsatz ROS-bildender Mikroglia, sowie eine hohe ROS-Bildungsintensität nachgewiesen. In infizierten SJL/J-Mäusen 99 d.p.i., die histopathologisch eine Demyelinisierung aufwiesen, zeigte sich die höchste ROS-Bildungsintensität. Eine gesteigerte ROS-Bildung könnte wesentlich an der Pathogenese der Demyelinisierung beteiligt sein. Auch in Hunden mit CDV-Infektion gilt eine erhöhte ROS-Bildung der Mikroglia als spezifisch. Infizierte Mäuse zeigten zu beiden Untersuchungspunkten eine höhere Phagozytoseaktivität als nicht-infizierte Kontrollmäuse. Gegenüber dem TMEV resistente C57BL/6-Mäuse zeigten 99 d.p.i. die höchste Phagozytoseaktivität, was für eine verbesserte Viruseliminierung sprechen könnte. Nicht-infizierte Kontrollmäuse besaßen zu beiden Untersuchungszeitpunkten mehr MHC I-positive Mikroglia im Vergleich zu infizierten Tieren und die höchste Expressionsintensität von MHC I+  zeigten Mikroglia der infizierten C57BL/6-Mäuse 99 d.p.i., was ebenfalls für eine bessere Viruseliminierung als die der infizierten SJL/J-Mäuse sprechen könnte. Vierzehn Tage p.i. zeigten Mäuse, die mit dem TMEV infiziert wurden, eine höhere Expression von IL-1ß als nicht infizierte Mäuse und infizierte Mäuse 99 d.p.i. Die infizierten Mäusestämme zeigten zu beiden Untersuchungszeitpunkten eine geringere Expressionsintensität von TNFα als die jeweiligen nicht-infizierten Kontrollmäuse. In dem Nagermodell konnten die immunphänotypischen und funktionellen Zeichen der Mikrogliaaktivierung in Hunden mit CDV-Infektion bestätigt werden. Bei der Entwicklung neuer Therapiestrategien für demyelinisierende Erkrankungen wie der Hundestaupe und der MS sollten die ambivalenten Eigenschaften der Mikroglia berücksichtigt werden. Ein Einsatz von Radikalfängern und die Förderung der Phagozytose zur Eliminierung des Virus könnten einer Demyelinisierung entgegenwirken. Die Epilepsie zählt zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen von Hund und Katze. Erythropoetin wirkt sowohl antiinflammatorisch, als auch neuroprotektiv und neurotrophisch. Durch die Gabe von Epo, die jedoch durch die damit verbundene Erythropoese eingeschränkt ist, kann die Frequenz und Schwere von Krampfanfällen reduziert werden. In einer zweiten Studie wurde der Effekt von Epo und pHBSP, einem nicht-erythropoetischen, mimetischen Peptid, auf die funktionelle Aktivität der Mikroglia von Ratten post SE untersucht. Weiblichen Sprague-Dawley Ratten wurde eine Teflon-beschichtete bipolare und rostfreie Stahlelektrode stereotaktisch in den rechten Nucleus der Amygdala implantiert, um einen Status epilepticus zu induzieren. Kontrolltieren wurden ebenfalls Elektroden implantiert, über die sie jedoch nicht stimuliert wurden. Nach Erreichen des Status epilepticus wurde den Ratten intravenös und subkutan Epo, pHBSP oder das Kontrollpeptid scrambled peptide, appliziert. Die subkutane Injektion wurde ein und drei Tage post SE wiederholt. Die Mikroglia wurde mit Hilfe eines Dichtegradienten aus den Gehirnen der Ratten isoliert und anschließend durchflusszytometrisch, immunphänotypisch und funktionell charakterisiert. Die Mikroglia wurden durch ihren charakteristischen Immunphänotyp CD18+, CD11b+ und CD45low identifiziert. Post SE waren die Mikrogliazellen aktiviert und es zeigte sich eine geringere mittlere Immunfluoreszenzintensität von MHC II, B7-2, IL-6 und TNFα in Ratten post SE, die mit Epo und pHBSP behandelt wurden, im Vergleich zu Ratten post SE, die mit scrambled peptide behandelt wurden. Auch die Phagozytoseaktivität und die ROS-Bildung der Mikroglia von Ratten post SE nach Behandlung mit Epo und pHBSP war geringer als von Mikroglia der Ratten ohne SE oder post SE, die mit scrambled peptide behandelt wurden. Die Wirkung von Epo auf die Mikroglia war stärker als die des mimetischen Peptids. Ein antiinflammatorisches Potential von Epo und pHBSP auf die Mikrogliaaktivität kann angenommen werden. Die entzündungshemmende Wirkung von Epo und pHBSP geben Hinweise für neue Epilepsietherapien oder neue Therapiestrategien für entzündliche ZNS-Erkrankungen, die an einem natürlichen Modell, wie dem Hund getestet werden könnten.

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Wagner, Stefanie: Funktionelle Charakterisierung der Mikroglia in Nagermodellen für Hundestaupe und Epilepsie. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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