Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zum Einfluss von Grassilagen mit auffällig niedrigen Reineiweißanteilen auf bislang nicht identifizierte Substanzen im Pansensaft (in vitro)

Wichern, Anika

The objective of the present study was to determine, if the composition of bovine ruminal fluid differs after in vitro fermentation of suspected grass silages with a true protein (TP) content < 50 % in the crude protein (CP) compared to control grass silages with a TP content > 50 % in the CP. Suspected grass silages are considered as the cause of clinical problems in dairy herds. Due to the low CP content of the silages used in the study, a special focus was set on differences in the peptide fractions and analytical procedures were adapted accordingly. A further aim of this study was to develop a method to analyse fermenter samples via LC-MS. In a mass screening the occurrence of specific mass-to-charge-ratios (m/z) after fermentation of different grass silages was investigated. Hereby, influence of feeding suspected grass silages on ruminal fermen- tation was evaluated. In previous studies, suspected grass silages (n = 10) as well as control silages (n = 7) were fermented in vitro using RUmen SImulation TEChnique. Fermenter samples and grass silages were analysed by RP-HPLC and peak areas were identified. Individual substances were further examined via LC-MS and MS/MS to characterise these substances according to specific m/z ratios and MS/MS fractions, respectively. Additionally, molecules with specific m/z were identified in fermenter fluid via mass screening using LC-MS.Peak areas of these molecules were determined and allocated to the individual grass silage. Six substances (1 - 6) were detectable in fermenter samples by RP-HPLC, but remained indetecable in used grass silages. Fermentation of suspected silages led to increased concentrations of substance 1 (up to + 54 %, p < 0.001), 2 (up to + 65 %, p < 0.001), 3 (up to + 25 %, p < 0.05) and 5 (up to + 44 %, p < 0.05) compared to controls. There were no differences in concentrations of substance 4 (p > 0.05) after fermentation of silages with different true protein content. Concentrations of substance 6 remained on a constant level after fermentation of suspected grass silages, whereas quantities decreased after control silage input, subsequently resulting in an up to 14 % increase of substance 6 for suspected silages (p < 0.05). As the concentrations of substance 1 differed most prominently between suspected and control silage fermentation, further analysis using LC-MS and MS/MS were carried out. This substance was then characterized with following m/z ratios: 249, 295, 348, 313 and 353. Efforts of further chemical characterisation of these substances were unsuccessful so far. Input of suspected silages to fermenters resulted especially in an increase of molecules with m/z ratios of 86 compared to controls. Regarding the entire period of silage addition molecule 86 increased by 150 %, (p < 0.01). Molecules with m/z ratios of 199 and 227 (up to + 139 %, p < 0.01) as well as 91 (up to + 34 %, p < 0.05) were also increased after fermentation of suspected silages compared to control silage. For other m/z ratios (75, 89, 105, 353b, 353c as well as 453 and 475) an influence of silages with different true protein content was not detectable (p > 0.05), while the results were heterogenous for the molecule with 353a m/z (+ 277 % to – 82 %). Results of this study indicate that fermentation of suspected silages leads to increased quantities of specific substances compared to control silages. None of these substances were detectable in extracts of original silages. As these substances and molecules could not be further identified, a statement about their clinical implication is so far not possible. Identification of these agents could be of importance to understand the interaction between feeding suspected grass silages and the occurrence of clinical symptoms in dairy herds.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob es nach der in vitro Inkubation von Schadgrassilagen mit einem Reineiweißanteil (RE) < 50 % am Rohprotein (Rp) im Vergleich zu Kontrollgrassilagen mit RE-Anteil > 50 % am Rp zu Änderungen in der Zusammensetzung des Pansensafts kommt. Schadgrassilagen werden als Ursache für Erkrankungen in Milchviehherden diskutiert. Aufgrund des niedrigen RE-Anteils der eingesetzten Silagen wurden insbesondere Unterschiede in der Peptidfraktion erwartet und die Analytik entsprechend ausgerichtet. Ein weiteres Ziel der Studie war es, eine neue Methode zur Vermessung von Fermenterproben an der LC-MS zu entwickeln. Im Massenscreening sollten ausgewählte Masse-zu-Ladungsverhältnisse (m/z) hinsichtlich ihres Vorkommens nach bestimmten Futterzulagen analysiert werden, um Rückschlüsse auf Fermentationsveränderungen durch Fütterung von Schadgrassilagen zu erhalten. In vorangegangenen Versuchen waren Schadsilagen (n = 10) sowie Kontrollsilagen mit (n = 7) in vitro mittels RUmen SImulation TEChnique fermentiert worden. Proben aus diesen Fermentern sowie eingesetzte Grassilagen wurden mit Hilfe der RP-HPLC aufgetrennt und die Flächenintegrale der Peaks ermittelt. Eine nähere Untersuchung der detektierten Substanzen auf spezifische m/z erfolgte mittels LC-MS sowie MS/MS. Im Massenscreening an der LC-MS wurden Moleküle mit charakteristischen Masse-zu-Ladungsverhältnissen in den Fermenterproben identifiziert. Die Flächenintegrale der Peaks dieser Moleküle wurden bestimmt und der jeweiligen Silagegabe zugeordnet. Mittels RP-HPLC-Analyse wurden sechs Substanzen (1 - 6) in allen Fermenterproben, jedoch nicht in den eingesetzten Grassilagen detektiert. Nach Fermentation von Schadsilagen erhöhten sich die Konzentrationen der Substanzen 1 um bis zu 54 % (p < 0,001), 2 um bis zu 65 % (p < 0,001), 3 um bis zu 25 % (p < 0,05) sowie 5 um bis zu 44 % (p < 0,05) gegenüber den Kontrollsilagen. Die Konzentrationen der Substanz 4 waren unabhängig (p > 0,05) von dem RE/RP Verhältnis der Silagen. Diejenigen der Substanz 6 blieben bei Zulage von Schadsilagen auf konstantem Niveau, fielen jedoch nach Zulage von Kontrollsilagen ab, so dass die Gehalte bei Schadgrassilagen- fermentation um bis zu 14 % (p < 0,05) höher waren als bei Kontrollsilagen. Da Substanz 1 am deutlichsten zwischen Schad- und Kontrollsilagenfermentation differierte, wurde diese Substanz mittels LC-MS bzw. MS/MS weiter analysiert. Die Massen von Substanz 1 betrugen 249, 295, 313, 348 sowie 353 m/z. Eine weitere chemische Charakterisierung der Moleküle gelang bislang nicht. Schadsilagen führten im Vergleich zu Kontrollsilagen insbesondere zu einem Anstieg des Moleküls mit 86 m/z. Dessen Konzentration war während der gesamten Zulagephase nach Schadsilagefermentation um bis zu 150 % (p < 0,01) höher. Auch Moleküle mit den Massen 91 (bis zu + 34 %, p < 0,05) sowie 199 und 227 m/z (bis zu + 139 %, p < 0,01) zeigten nach der Fermentation mit Schadsilage höhere Werte als nach derjenigen mit Kontrollsilage. Andere detektierte Molekülmassen (75, 89, 105, 353 b, 353 c sowie 453 und 475 m/z) unterschieden sich nicht (p > 0,05) in Abhängigkeit von der Art der Silagezulage, während das Molekül mit der Masse 353 a heterogene Ergebnisse aufwies (+ 277 % bis – 82 %). Schlussfolgernd lässt sich feststellen, dass die Fermentation von Schadsilagen im Vergleich zu Kontrollsilagen einen Konzentrationsanstieg bestimmter Substanzen in den Fermenterproben bewirkte, die nicht bereits in den Silagen enthalten waren. Des Weiteren führte die Schadsilagefermentation zu einem Anstieg bestimmter Moleküle. Auf Grund der Tatsache, dass eine chemische Identifizierung dieser Substanzen und Moleküle bislang nicht gelang, können keine Aussagen über ihre Bedeutung getroffen werden. Ihre Identifizierung könnte aber für das Verständnis der Zusammenhänge zwischen der Fütterung von Schadsilagen und der Entstehung spezifischer Krankheits- symptome von Bedeutung sein.

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Wichern, Anika: Untersuchungen zum Einfluss von Grassilagen mit auffällig niedrigen Reineiweißanteilen auf bislang nicht identifizierte Substanzen im Pansensaft (in vitro). Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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