Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchung der Thrombingenerierung des Hundes

Witten, Christina

The aim of the present study was the measurement of thrombin generation (TG) in dogs by use of the Calibrated automated Thrombography (CAT) method in terms of the evaluation of methodical aspects, the generation of reference values and the influence of different diseases (haemophilia A, haemophilia B, hyperadrenocorticism, inflammatory processes, lymphoma, histiocytic sarcoma, lymphatic leukaemia) on TG parameters: lag time, peak, endogenous thrombinpotential (ETP), time to peak and reaction time. The aim of the methodical pre-trial was to evaluate the influence of cryoconservation, tissue factor (TF) concentration and the addition of corn trypsin inhibitor (CTI) on the TG parameters. Therefore citrated platelet poor plasma of 16 healthy dogs and three dogs with haemophilia A was used. Half of the plasma of each dog was measured directly, that is, within three to four hours, the other half after four weeks of cryoconservation. CTI was added at two different times: the inhibitor was either given into a test tube before collection of the blood sample or it was added to the plasma right before the measurements. In this way the measurement of TG was carried out in 6 conditions for each dog with three different TF concentrations (1, 5 and 20 pM): (1) fresh native plasma, (2) fresh plasma, CTI added to the test tube, (3) fresh plasma, CTI added to the plasma, (4) cryoconservated native plasma, (5) cryoconservated plasma already containing CTI, (6) cryoconservated plasma, CTI added to the plasma. The three-way ANOVA of the healthy dogs showed no significant influence (p > 0.05) of cryoconservation on the results. The comparison of native plasma with plasma containing CTI by means of a three-way ANOVA demonstrated a significant influence of CTI on peak, ETP, time to peak and reaction time (p < 0.05). Subsequently a multiple t-test (Tukey Kramer) was performed, showing no significant differences between the CTI administration times (p > 0.05) at the different TF concentrations. The comparison of native plasma with plasma containing CTI by means of the Tukey Kramer test demonstrated a significant influence of CTI on peak, ETP, time to peak and reaction time at a TF concentration of 1 pM (p < 0.05). Comparing the different TF concentrations via three-way ANOVA showed significant differences (p < 0.0001): with increasing TF concentration the lag time, time to peak and reaction time decreased and the peak and ETP increased. Based on the results of the methodical pre-trial it can be concluded that cryoconservated plasma is generally suitable for the analysis of TG and that the addition of CTI has a significant influence only at a low TF concentration of 1 pM. On the basis of the results of the methodical pre-trial the final method was determined. For further measurements cryoconservated plasma was used natively and with addition of CTI to the plasma before analysis was undertaken. For the generation of reference values plasma of another 46 healthy dogs was examined by use of the final method. The results were summarised with the according measurements of the healthy dogs examined in the methodical pre-trial and data was used for statistical analysis. At a TF concentration of 1 pM the mean peak was 73.4 nM (37.1–143 nM; 2.5–97.5 quantile) and at 5 pM TF it was 125 nM (85.3–173 nM). At 1 pM TF ETP was averagely 253 nM/min (177–368 nM/min) and at 5 pM TF it was 347 nM/min (249–496 nM/min). In comparison to healthy dogs, those with haemophilia A showed a significantly lower peak at the TF concentration 1 and 5 pM (p < 0.05) in native plasma and in plasma containing CTI at 1 pM TF (p = 0.0025). There was an increase in the lag time in both conditions at 1 and 5 pM TF. Time to peak and reaction time were (in part) significantly prolonged as well. These results imply the connection to the degree of clinical severity; however, due to the small number of patients the power of the results is limited. The examination of three dogs diagnosed with haemophilia B showed evidence of a lower mean peak (36.0 nM) and ETP (186 nM/min) at a TF concentration of 1 pM. Plasma of dogs with hyperadrenocorticism was significantly higher in ETP (p < 0.05) at all TF concentrations and had a higher peak (p = 0.0014) of thrombin at 5 pM TF compared to the healthy group. ETP was 501 ± 127 nM/min in dogs diagnosed with Cushing’s disease versus 377 ± 72.7 nM/min in healthy dogs. Dogs with inflammatory processes showed a significantly increased ETP in comparison to the healthy dogs at all TF concentrations in native plasma, but only at 1 and 5 pM TF in CTI containing plasma (p < 0.05). Additionally dogs with inflammatory processes showed a significantly prolonged reaction time in native plasma at all TF concentrations and in plasma containing CTI at 20 pM TF only. However, in CTI containing plasma there was a significantly increased peak at 1 and 5 pM TF compared to the healthy dogs. Dogs diagnosed lymphoma only showed a significantly prolonged time to peak in both conditions compared to healthy dogs (p < 0.05). Compared to healthy dogs, those diagnosed with histiocytic sarcoma showed a higher peak in native plasma at 1 pM TF (p = 0.0097). In native plasma at 1 pM TF (p = 0.0249) and in CTI containing plasma at 1 and 20 pM TF (p < 0.05) ETP was higher than in healthy dogs. The reaction time was prolonged at 1 and 20 pM TF in native plasma and at 20 pM TF in CTI containing plasma (p < 0.05). Dogs with acute onset of lymphatic leukaemia had a prolonged lag time in both conditions at 1 pM TF (p < 0.05) and an increased peak in both conditions at 1 and 5 pM TF (p < 0.05) compared to the healthy control group. ETP was only elevated in CTI containing plasma at 1 pM TF (p = 0,0385), whereas reaction time was prolonged in native plasma at all TF concentrations and in CTI containing plasma at 20 pM TF (p < 0.05). In the second part of the present study distinct changes in TG were found in dogs with different diseases. The increased ETP in dogs with Cushing’s disease is in accordance with the hypercoagulability described in literature. The results of the haemophilic dogs are promising with regard to the clinical severity of the hypocoagulability; however, this should be validated in a greater number of dogs.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Thrombingenerierung (TG) des Hundes nach der „Calibrated automated Thrombography“ (CAT)-Methode. Dafür wurden methodische Aspekte evaluiert, Referenzwerte erstellt und die Auswirkung verschiedener Erkrankungen (Hämophilie A und B, Hyperadrenokortizismus, entzündliche Erkrankungen, Lymphom, histiozytäres Sarkom und akute lymphatische Leukämie) auf die TG-Parameter Latenzzeit, Peak, endogenes Thrombinpotential (ETP), Zeit bis zum Peak und Reaktionsdauer untersucht. Der methodische Vorversuch diente der Untersuchung des Einflusses der methodischen Aspekte Gefrierkonservierung, Tissue Factor (TF)-Konzentration und Corn Trypsin Inhibitor (CTI)-Zugabe auf die TG-Parameter. Dafür wurde das plättchenarme Zitratplasma von 16 gesunden Hunden und 3 Hunden mit Hämophilie A verwendet. Die Hälfte des Plasmas jedes Hundes wurde frisch, d.h. innerhalb von drei bis vier Stunden, die andere Hälfte nach vierwöchiger Gefrierkonservierung gemessen. Die CTI-Zugabe erfolgte zu zwei verschiedenen Zeitpunkten, zum Einen wurde der Inhibitor dem Probenröhrchen vor der Blutabnahme zugesetzt, zum Anderen erfolgte die Zugabe zum Plasma direkt vor Beginn der Messung. Demnach erfolgte die Messung der TG für jeden Hund in insgesamt sechs Ansätzen mit jeweils drei verschiedenen TF-Konzentrationen (1, 5 und 20 pmol/l): (1) frisches natives Plasma, (2) frisches Plasma, CTI-Zusatz zum Probenröhrchen, (3) frisches Plasma, CTI-Zusatz zum Plasma, (4) gefrierkonserviertes natives Plasma, (5) gefrierkonserviertes Plasma, CTI bereits enthalten (CTI-Zusatz zum Probenröhrchen), (6) gefrierkonserviertes Plasma, CTI-Zusatz zum Plasma. Die statistische Auswertung der gesunden Hunde mittels 3-faktorieller Varianzanalyse ergab keinen signifikanten Einfluss (p > 0,05) der Gefrierkonservierung auf die Ergebnisse. Die 3-faktorielle Varianzanalyse zeigte weiterhin einen signifikanten Einfluss des CTIs auf den Peak, das ETP, die Zeit bis zum Peak und die Reaktionsdauer (p < 0,01). Der anschließend durchgeführte multiple t-Test Tukey Kramer ergab bei keiner TF-Konzentration einen signifikanten Unterschied zwischen den CTI-Zugabezeitpunkten (p > 0,05). Der Vergleich des nativen Plasmas mit dem CTI-haltigen Plasma zeigte nur bei einer TF-Konzentration von 1 pmol/l einen signifikanten Einfluss des CTIs auf die Parameter Peak, ETP, Zeit bis zum Peak und Reaktionsdauer (p < 0,05). Der Vergleich der verschiedenen TF-Konzentrationen mittels 3-faktorielle Varianzanalyse ergab signifikante Unterschiede (p < 0,0001), so konnte bei steigender TF-Konzentration eine Verkürzung der Latenzzeit, der Zeit bis zum Peak und der Reaktionsdauer und eine Erhöhung des Peaks und des ETPs beobachtet werden. Aus den Ergebnissen des methodischen Vorversuchs kann geschlussfolgert werden, dass gefrierkonserviertes Plasma gesunder Hunde prinzipiell für die Analyse geeignet ist und der Zusatz von CTI einen signifikanten Einfluss nur bei einer niedrigen TF-Konzentration von 1 pmol/l ausübt. Anhand der Ergebnisse des methodischen Vorversuchs wurde die endgültige Methodik festgelegt. Für die weiteren Messungen gesunder und erkrankter Hunde wurde gefrierkonserviertes Plasma mit und ohne Zusatz von CTI zum Plasma vor Beginn der Messung verwendet. Für die Erstellung von Referenzwerten wurde das Plasma von 46 weiteren gesunden Hunden nach der endgültigen Methodik untersucht. Die Ergebnisse wurden mit den entsprechenden Messungen der gesunden Hunde des methodischen Vorversuchs zusammengefasst und statistisch ausgewertet. Bei einer TF-Konzentration von 1 pmol/l lag der mittlere Peak bei 73,4 nmol/l (37,1–143 nmol/l; 2,5–97,5% Quantil) und bei 5 pmol/l TF bei 125 nmol/l (85,3–173 nmol/l). Das ETP wies bei 1 pmol/l TF einen Wert von durchschnittlich 253 nmol/l x min (177–368 nmol/l x min) und bei 5 pmol/l TF einen Wert von 347 nmol/l x min (249–496 nmol/l x min) auf. Hunde mit Hämophilie A hatten gegenüber gesunden Hunden einen signifikant erniedrigten Peak bei den TF-Konzentrationen 1 und 5 pmol/l im nativen Plasma (p < 0,05) und im CTI-haltigen Plasma bei 1 pmol/l (p = 0,0025). Die Latenzzeit zeigte sich in beiden Ansätzen bei 1 und 5 pmol/l TF verlängert (p < 0,05), auch die Zeit bis zum Peak und die Reaktionsdauer zeigten teils signifikant verlängerte Werte. Die Ergebnisse deuten einen Zusammenhang zum klinischen Schweregrad an, allerdings schränkt die geringe Patientenanzahl die Aussagekraft ein. Die Untersuchung von drei Hunden mit Hämophilie B ergab bei einer TF-Konzentration von 1 pmol/l einen durchschnittlich erniedrigten Peak (36,0 nmol/l) und ein niedrigeres ETP (186 nmol/l x min) im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe. Hunden mit einem Hyperadrenokortizismus hatten im Vergleich zu der gesunden Kontrollgruppe ein signifikant erhöhtes ETP bei allen TF-Konzentrationen (p < 0,05) und einen höheren Thrombinpeak bei 5 pmol/l TF (p = 0,0014) im Nativplasma. Beispielsweise lag das mittlere ETP der erkrankten Hunden bei 501 ± 127 nmol/l x min (5 pmol/l TF), bei gesunden Hunden hingegen nur bei 377 ± 72,7 nmol/l x min. Die Hunde mit entzündlichen Erkrankungen zeigten gegenüber gesunden Hunden im nativen Plasma bei allen TF-Konzentrationen ein signifikant erhöhtes ETP, im CTI-haltigen Plasma nur bei 1 und 5 pmol/l TF (p < 0,05). Weiterhin wies diese Gruppe eine signifikant verlängerte Reaktionsdauer im nativen Plasma bei allen TF-Konzentrationen und im CTI-haltigen Plasma nur bei 20 pmol/l TF auf (p < 0,05). Allerdings zeigte sich im CTI-haltigen Plasma zusätzlich ein signifikant erhöhter Peak (p < 0,05) bei 1 und 5 pmol/L TF gegenüber der gesunden Hunden. Hunde mit einem Lymphom zeigten im Vergleich zu gesunden Hunden nur eine signifikant verlängerte Zeit bis zum Peak (p < 0,05) in beiden Ansätzen. Hingegen konnte bei den Hunden mit einem histiozytären Sarkom ein erhöhter Peak (p = 0,0097) im native Plasma bei 1 pmol/l TF gezeigt werden. Das ETP war im nativen Plasma bei 1 pmol/l TF (p = 0,0249) und im CTI-haltigen Plasma bei 1 und 20 pmol/l (p < 0,05) erhöht gegenüber gesunden Hunden. Die Reaktionsdauer war im nativen Plasma bei 1 und 20 pmol/l TF und im CTI-haltigen Plasma bei 20 pmol/l TF verlängert (p < 0,05). Hunde mit einer akuten lymphatischen Leukämie wiesen im Vergleich zu der gesunden Referenzgruppe eine verlängerte Latenzzeit in beiden Ansätzen bei 1 pmol/l TF auf (p < 0,05). Weiterhin zeigte diese Gruppe einen erhöhten Peak in beiden Ansätzen bei 1 und 5 pmol/l TF (p < 0,05), ein erhöhtes ETP im CTI-haltigen Plasma bei 1 pmol/l TF (p = 0,0385) und eine verlängerte Reaktionsdauer im nativen Plasma bei allen TF-Konzentrationen und im CTI-haltigen Plasma bei 20 pmol/l TF (p < 0,05). Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden deutliche Veränderungen der TG bei Hunden mit verschiedenen Erkrankungen gefunden. Das erhöhte ETP bei Hunden mit dem Cushing-Syndrom passt zu der, aus der Literatur bekannten, Hyperkoagulabilität bei dieser Erkrankung. Im Hinblick auf die Einschätzung des Schweregrades der Hypokoagulabilität bei Hämophilie zeigen sich die ersten Ergebnisse vielversprechend, dies sollte aber an einer größeren Tierzahl überprüft werden.

Quote

Citation style:

Witten, Christina: Untersuchung der Thrombingenerierung des Hundes. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export