Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Licht- und transmissionselektronenmikroskopische Charakterisierung der Läsionsentwicklung während der experimentellen Theilerschen murinen Enzephalomyelitis unter besonderer Berücksichtigung von Axonopathien und der Apoptoseinduktion

Elmarabet, Suliman Ahmed

An introduction reviews the experimental Theilervirus-infection as a model for human demylinating diseases is given. Further more, the role of apoptosis in demyelinating diseases as well the importance of axonopathies and alterations of the blood brain barrier in human and veterinary disorders of the central nervous system is summarized. Spinal cord tissue of female SJL/JHanHsd mice, experimentally infected with the BeAnstrain of the Theilervirus (TMEV) was investigated. The animals were infected intracerebrally with the TMEV and sacrificed at 14, 42, 98, 147, 196 and 245 days post infection (dpi). For the visualisation of inflammation, spheroid formation and demyelinaiton, formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections were stained with hematoxylin and eosin and luxol fast blue-cresyl violet staining, respectively. Axon density was quantified by morphometry using Bielschowskys-silver staining. Apoptosis induction was determined by immunohistochemistry (detection of activated caspase-3) and TUNEL-technique. For ultrastructural analysis, spinal cord tissue was embedded in epoxy resin and invesigated by transmission electron microscopy. Single inflammatory foci in the spinal cord meninges and parenchyma of infected mice were detected by light microscopy as early as 14 dpi. Subsequently, a progressive lymphohistiocytic meningoleukomyelitis and demyelination was observed. In addition, high numbers of apoptotic cells were determined by immunohistochemisty and TUNELtechnique at 14 dpi in the spinal cord white matter. In contrast, during the late chronic infection phase (147 to 245 dpi) a reduced apoptosis rate was present in affected mice. Transmission electron microscopy revealed the occurrence of oligodendroglial apoptosis in the predemyelinating phase (14 dpi). Later, starting at 42 dpi, axonal alterations were observed by ultrastructural analysis. Here, axonal degeneration and axonal dystrophy were most prominent, while reactive axons and axonal regeneration were rare and restricted to the chronic infection stage. In the late chronic phase remyelination induced by oligodendrocytes and Schwann cells was present in spinal cord lesions. Starting at 14 dpi, vascular endothelium showed degenerative changes with fibrin extravasation. However, tight junctions of endothelial cells remained intact during the entire study period. In summary, the findings revealed the occurence of reversible and irreversibly damage of different cell types following experimental TMEV infection of mice. Axonopathies and myelin alterations exhibited similarities with lesions observed in MS patients, demonstrating the suitability of this murine model to study the pathogenesis of demyelinating disorders. A novel aspect of the present study was the detection of different types of axonal alterations and the occurrence of potentially protective processes, such as reactive axons and axonal regeneration in association with oligodendrocyte-type and Schwann cell-type remyelination during the chronic infection phase. Oligodendrocyte apoptosis precedes myelin loss and might represent a prerequisite for subsequent demyelination and axonal damage. Further, reduced apoptosis induction during the chronic phase is a proposed consequence of inhibited activation induced cell death of immune cells, which leads to prolonged inflammation, as observed in the chronic phase of MS. Vascular degenerative alteration with perivascular fibrin accumulation represents an early event in TMEV-infected mice and might lead to an activation of resident microglial cells and lesion initiation in the spinal cord. However, the presence of intact tight junctions of the vascular endothelium is indicative of a closed blood brain barrier, which potentially favours a compartimentalization of immune responses during the chronic TME phase.

In der Literaturübersicht wird die Pathogenese der murinen Theilervirus-Enzephalomyelitis beschrieben und ihre Bedeutung als experimentelles Tiermodell für die Multiple Sklerose des Menschen erläutert. Darüber hinaus wird eine allgemeine Übersicht über die Apoptose und deren Bedeutung bei Entmarkungskrankheiten gegeben. Weiterhin wird die Rolle von Axonopathien und der Bluthirnschranke bei demyelinisierenden Erkrankungen von Mensch und Tier beschrieben. In der Studie wurde das Rückenmarksgewebe von weiblichen SJL/JHanHsd-Mäusen untersucht. Die Tiere wurden experimentell mit dem BeAn-Stamm des murinen Theiler- Enzephalomyelitisvirus (TMEV) intrazerebral infiziert und nach 14, 42, 98, 147, 196 und 245 Tage nach der Infektion getötet. Die formalinfixierten und paraffineingebetteten Gewebeschnitte wurden mittels Hämatoxylin-Eosin (HE)- und Luxol Fast Blue- Kresylechtviolett (LFB-KEV)-Färbung zur Darstellung der Entzündung, der Sphäroidbildung und des Demyelinisierungsgrades gefärbt. Außerdem wurde die Axondichte morphometrisch anhand von Bielschowsky-gefärbten Schnitten ermittelt. Der Nachweis der Apoptoseinduktion erfolgte mittels Immunhistochemie (Nachweis der aktivierten Caspase-3) und der TUNEL-Methode. Für die ultrastrukturellen Charakterisierungen der Läsionen wurden Segmente der Halswirbelsäulen in Kunstharz eingebettet und mittels eines Transmissionselektronenmikroskops untersucht. Bei der lichtmikroskopischen Untersuchung der TMEV-infizierten Mäuse wurden bereits am 14. Versuchstag einzelne Entzündungsherde in den Meningen und dem Neuroparenchym des Rückenmarks nachgewiesen. In der späteren Infektionsphase (ab dem 42. Versuchstag) kam es zu einer Zunahme der Intensität der lymphohistiozytären Meningoleukomyelitis und einer deutlichen Demyelinisierung. Weiterhin konnten bereits ab dem 14. Infektionstag zahlreiche apoptotische Zellen mittels Immunhistologie und der TUNEL-Methode in der weißen Substanz erkannt werden. Eine reduzierte Apoptoserate fand sich hingegen in der Spätphase der Infektion (147.-245. Versuchstag). Mittels Transmissionselektronenmikroskopie waren bereits vor dem Auftreten der Entmarkung (14. Versuchstag) apoptotische Vorgänge der Oligodendrozyten zu erkennen. Ab dem 42. Versuchstag konnten ultrastrukturell zusätzlich axonale Alteration nachgewiesen werden. Hierbei traten vorwiegend axonale Degenerationen und axonale Dystrophien auf, sowie seltener, insbesondere im chronischen Stadium, reaktive Axone und axonale Regeneration. In der Spätphase der Infektion konnten außerdem Remyelinisierungsvorgänge durch Oligodendrozyten und nachfolgend durch Schwannzellen erkannt werden. Ab dem 14. Versuchstag waren degenerative Veränderungen des Gefäßendothels mittels Fibrinextravasationen elektronenmikroskopisch nachzuweisen. Allerdings fanden sich keine Veränderungen der Zonulae occludentes der Endothelzellen. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl reversible als auch irreversible Prozesse in verschiedenen Zellpopulationen infolge der experimentellen TMEV-Infektion detektiert. Die beschriebenen Axonopathien und Myelinveränderungen wiesen deutliche Ähnlichkeiten mit denen von MS Patienten auf, was die Bedeutung der experimentellen Theilervirus-Infektion als Pathogenesemodell für humane demyelinisierende Erkrankungen unterstreicht. Ein besonderer Aspekt der Arbeit ist weiterhin der Nachweis von potentiell neuroprotektiven Prozessen, wie das Auftreten von reaktiven Axonen und axonalen Regenerationen in der chronischen Krankheitsphase sowie die zeitlich versetzte Remyelinisierung durch Oligodendrozyten und Schwannzellen innerhalb der Herdläsionen. Der Nachweis von apoptotischen Oligodendrozyten in der prädemyelinisierenden Phase spricht für eine potentielle Rolle von Oligodendropathien für die Initiation der Myelinveränderungen und Axonopathien. Vergleichbar den Verhältnissen bei der MS fanden sich in der chronischen Phase der TME außerdem Hinweise auf eine verminderte Apoptoseinduktion, was auf eine Apoptoseresistenz von Immunzellen schließen lässt und möglicherweise für die chronische und langanhaltende Entzündung mitverantwortlich ist. Das frühzeitige Auftreten von reversibel degenerativen Veränderungen der Blutgefäße bei TMEV-infizierten Mäusen mit Fibrinextravasation führt vermutlich zur Aktivierung von residenten Gliazellen und damit zur Entwicklung der Rückenmarksläsionen. Allerdings konnten keine Veränderung der Zonulae occludentes nachgewiesen werden, was insbesondere während der chronischen Phase für eine intakte Blut-Rückenmark-Schranke spricht und eine Kompartimentalisierung der Immunreaktion im ZNS der Versuchstiere potentiell ermöglicht.

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Elmarabet, Suliman Ahmed: Licht- und transmissionselektronenmikroskopische Charakterisierung der Läsionsentwicklung während der experimentellen Theilerschen murinen Enzephalomyelitis unter besonderer Berücksichtigung von Axonopathien und der Apoptoseinduktion. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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