Charakterisierung eines murinen Norovirus

Achard, Marcel

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Charakterisierung eines murinen Norovirus

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Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein murines Norovirus (MNV), das aus Anzeiger-Mäusen des Zentralen Tierlaboratoriums (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) isoliert wurde, charakterisiert. Die genetische Sequenz wurde bestimmt und wies eine 95% Übereinstimmung zu MNV-4 auf. Sie wurde unter der Zugangsnummer EU854589 veröffentlicht. Zusätzlich wurden elektronenmikroskopische Aufnahmen der Virusstruktur erstellt. Die erfolgreiche Anzucht und Vermehrung von MNV in RAW 264.7-Zellen ermöglichte die Etablierung diagnostischer Tests in Form von PCR und Serologie (ELISA). Mit Hilfe der serologischen Diagnostik wurde die Prävalenz für MNV im Zentralen Tierlaboratorium der MHH für den Überwachungszeitraum 2007/2008 erfasst. MNV-positive Anzeiger-Mäuse wurden nur in der experimentellen Barriere gefunden. Die Prävalenzrate bewegte sich je nach Tierraum zwischen 8% und 61%. Die Auswirkung von MNV auf das Tiermodell der IL10-defizienten Maus (Il10-/-) wurde anhand von zwei genetischen Hintergrundstämmen, C3H/HeJBirZtm (C3) sowie C57BL/6JZtm (B6), im Infektionsversuch untersucht. Alle infizierten Mäuse wiesen eine Serokonversion auf. Es kam zu keiner klinischen Beeinträchtigung. MNV war bei den infizierten Mäusen nur in Organen des Gastrointestinaltraktes per PCR nachweisbar. Kot, Kolon und Mesenteriallymphknoten waren als Probenmaterial besonders geeignet für einen PCR-Erregernachweis. Es konnten keine schwerwiegenden histologischen Veränderungen im Vergleich zu nicht mit MNV infizierten Kontrollmäusen ausgemacht werden. Bei einigen mit MNV infizierten C3-Il10-/--Mäusen wurden jedoch sehr milde fokale entzündliche Veränderungen im Kolon festgestellt. Die Interferon (INF)γ-Sekretion in vitro stimulierter Darmlymphozyten von mit MNV infizierten Mäusen war 2 Wochen nach der Infektion erhöht im Vergleich zur nicht infizierten Kontrollgruppe. Bei infizierten C3-Il10-/--Mäusen war die IFNγ-Sekretion 4 Wochen nach der Infektion weiterhin erhöht. Keimfrei gehaltene C3-Il10-/--Mäuse, die mit MNV infiziert wurden, wiesen 4 Wochen nach der Infektion keine entzündlichen histologischen Veränderungen oder eine gesteigerte IFNγ-Sekretion auf. Demnach kann MNV nur in Verbindung mit einer endogenen bakteriellen Darmflora einen kolitogenen Stimulus erzeugen. Ein Doppelinfektionsversuch mit MNV und 14 Tage später mit Helicobacter (H.) hepaticus sollte zeigen, ob eine vorhergehende Infektion mit MNV eine entzündliche Darmerkrankung, ausgelöst durch H. hepaticus, verstärken kann. Die Kontrollgruppe wurde nur mit H. hepaticus infiziert. Alle Mäuse wurden 6 Wochen nach der Infektion mit H. hepaticus seziert. Die Befunde der Klinik, Histologie und IFNγ-Sekretion wiesen keine deutlichen Unterschiede auf. Hieraus lässt sich folgern, dass MNV die Entwicklung einer durch H. hepaticus hervorgerufenen Entzündung bei der IL10-defizienten Maus nicht verstärkt. Dennoch zeigen die vorhergehenden Versuche, dass die Interaktion von MNV mit einer endogenen apathogenen Darmflora bei der IL10-defizienten Maus zu einer milden Entzündungsreaktion im Darm führen kann. Dies macht MNV zu einem nicht zu vernachlässigenden Faktor im Tierversuch.

Aim of this study was to characterize a murine norovirus (MNV) that was isolated from sentinel-mice of the Central Animal Facility (Ztm) at HannoverMedicalSchool. Genetic sequencing was performed and showed 95% identity with MNV-4. The sequence was published under the accession number EU85489. Additionally, the virus structure of MNV was depicted by electron microscopy. The successful replication of MNV in RAW 264.7-cells allowed us to establish several diagnostic tests as PCR and serology (ELISA). Therefore, it was possible to determine the prevalence of MNV at the Ztm for the years of 2007 and 2008. MNV-positive mice were only found in the experimental barrier. Prevalence among animal rooms differed from 8% to 61%. In order to analyse the influence of MNV on IL10-defficient mice (Il10-/-), Il10-/- mice on genetic background strains C3H/HeJBirZtm (C3) and C57BL/6JZtm (B6) were experimentally infected. Although seroconversion could be detected in all infected animals, no clinical effects were visible. The detection of MNV in infected mice was solely possible in organs of the gastro-intestinal tract. Faeces, colon and mesenteric lymph nodes were suitable material for the detection of MNV via PCR. Histological examinations of MNV-positive mice did not show grave differences in comparison to control mice. Nevertheless, few individuals belonging to the C3-Il10-/- group showed mild focal inflammations of the colon. In vitro stimulated intestinal lymphocytes of MNV-positive mice secreted significantly more interferon (IFN)γ two weeks post infection (p.i.) than those of the control group. Infected animals belonging to the C3-Il10-/- group showed an increased IFNγ-secretion up to four weeks p.i. Sterile housed C3-Il10-/--mice that were infected with MNV neither showed inflammatory changes of the colon nor an increased secretion of IFN-γ four weeks p.i. Therefore, MNV is only able to induce a colitogenic stimulus in combination with an endogenous bacterial intestinal flora. A dual infection experiment with MNV and Helicobacter (H.) hepaticus (14 days subsequent to the MNV infection) was intended to clarify the question, whether a preceding infection with MNV aggravates inflammatory diseases of the bowel. A control group was only infected with H. hepaticus. All mice were sacrificed six weeks p.i. with H. hepaticus. No obvious differences in clinical signs, intestinal pathology or INFγ secretion were observed. Therefore, it is suggested that MNV does not exacerbate inflammatory diseases resulting from a H. hepaticus infection in IL10-deficient mice. Nevertheless, the preceding experiments demonstrate the interaction of MNV with the endogenous, non-pathogenic intestinal flora in IL10-deficient mice. Thus, an infection with MNV should be considered as a confounding variable in animal experimentation using mouse models.