Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Analyse der zellulären Immunantwort gegen SV40 T-Antigen-induzierte Mammakarzinome im transgenen Mausmodell

Wanger, Jara

Cancer is the major cause of death worldwide, causing 13% of all mortalities. Breast cancer is the cause of death of 519 000 women per year and is ranked fifth amongst cancers which result in death (WHO, Fact sheet No. 297, February 2009). Due to its high biological and genetic heterogenity, breast cancer is an umbrella term for many different malignant diseases of the mammary gland. Even though a histological and molecular tumor classification exists, this heterogenity often leads to significant differences in the therapeutic outcomes of the disease. Alongside early detection, the development of more "specialized" therapies is one of the most important preventive measures. One of the main tasks of modern cancer research is to discover new targets for a more specific destruction of the tumor cells. The re-activation of the immune system is a promising approach. The inducible WAP-T and WAP-T-NP mouse model for breast cancer, which has been established on the BALB/c genetic background, is an appropriate animal model for the analysis of tumor progression at different time points during cancer development. In these mice, the tissue-specific WAP promoter is activated by lactogenic hormones during pregnancy and lactation. This leads to an expression of the transgene in the epithelial cells of the mammary gland. The transgenes either express the SV40 T-Ag (WAP-T mouse line) or the SV40 T-Ag and the inserted NP-epitope of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) (WAP-T-NP8 mouse line). In rodent cells, T-Ag represents a tumor-initiating oncoprotein, which causes a cell transformation by the inactivation of the tumor suppressor proteins pRb and p53. The developing intraepithelial neoplasia (mammary intraepithelial neoplasia, MIN) show a strong similarity to the human ductal carcinoma in situ (ductal carcinoma in situ, DCIS). The NP-epitope of LCMV demonstrates for BALB/c mice a highly immunogenic CTL epitope. Although the transgene is expressed primarily during late pregnancy and lactation, the transgenic mice are tolerant to T-Ag. However, the WAP-T-NP8 mice are astonishingly capable of developing a LCMV-eliminating CTL response, as well as wt BALB/c mice. It would therefore appear that the WAP-T-NP8 animals are not tolerant to the NP-epitope. Unlike the WAP-T mice (which lack the NP-epitope), the WAP-T-NP8 mice do not show any differences in tumor development after induction, although they are able to develop a LCMV-eliminating CTL response.  Consequently, there was confusion with respect to the immune competence of the WAP-T-NP8 animals and the NP-epitope. In this study the efficiency of the T cell response was analyzed by comparing transplantations of H8N8 mammary carcinoma cells (expression of T-Ag and NP-epitope) in WAP-T-NP8, wt BALB / c and CD 8 T cell-depleted BALB/c mice. The results of these studies were very consistent: while all the CD 8-depleted BALB/c and the transgenic WAP-T-NP8 mice were unable to reject the tumor cells and developed tumors, all untreated BALB/c mice were capable of a tumor cell rejection. The results of the wt animals and the CD 8-depleted BALB/c mice demonstrated the importance of an effective CTL response for the elimination of tumor cells. Furthermore, these experiments have confirmed that the NP-epitope presented together with T-Ag is not recognized as “foreign” in transgenic animals. To clarify why the WAP-T-NP8 animals are able to recognize and eliminate NP-epitope-expressing LCMV-infected cells, but not T-Ag and NP-epitope-presenting tumor cells, the expression of PD-L1 - as a possible immune escape mechanism - was further analyzed. This transmembrane surface molecule was first described for the chronic LCMV infection and leads to a negative regulation of the T-cell response. The expression of PD-L1 has already been described for various chronic human viral infections (HIV, HBV, HCV) and also for human cancers. For the determination of their PD-L1 state, the breast cancer cells (H8N8 and G-2 cells) and the resulting tumors, as well as endogenous WAP-T-NP8 tumors were analyzed using different methods. Thus, the H8N8 and G-2 cells in vitro could be classified as PD-L1 negative, while in half of the 50 endogenous mammary carcinomas of WAP-T-NP mice with varying degrees of differentiation (Grading), a more or less intense PD-L1 expression was detectable in the immunohistochemistry. There was a significant correlation between the expression level of PD-L1 and the degree of differentiation of the tumors (undifferentiated G3 and G4 carcinomas). The PD-L1 expressing tumors were further characterized by using additional markers. The differentiation between PD-L1 positive tumor cells (PD-L1+/ T-Ag+) and also PD-L1 expressing cytokeratin (CK) negative, tumor-infiltrating immune cells (PD-L1+/CK 14+or PD-L1+/CK8/18+) was realised by a double labeling in the immunofluorescence. Tumor-infiltrating T cells (CD 3) and tumor-associated macrophages (Mac 3) were evaluated separately by immunohistochemistry. By means of their cytokeratin expression the PD-L1 positive cells could not be related to a specific tumor cell subpopulation. However, there were indications that undifferentiated carcinomas with a strong PD-L1 expression have a higher proportion of CK 14 positive cells compared to weak PD-L1 expressing undifferentiated tumors. The fact that the stimulation with interferon-gamma could induce the expression of PD-L1 on H8N8 and G-2 cells in cell culture lead to the assumption that in vivo interferon-gamma is also a key parameter for the expression of PD-L1. This was verified by analyzing a further interferon-sensitive surface marker (Sca-1). A positive correlation between the Sca-1 and PD-L1 expression in vitro and in vivo could thereby be observed. In summary, the findings obtained in this work clearly demonstrate how effectively the immune system can act against tumor cells under certain conditions.  They also demonstrate the complexity of its modulation as well as the critical importance of research into these complexities for the development of new immunotherapies. Due to the similarity between the WAP-T mouse model and the corresponding human breast cancer disease and a confirmed study of PD-L1 expression in patients with infiltrating ductal carcinoma (infiltrating ductal carcinoma, IDC) (Ghebeh et al., 2006), it is very likely that other types of human breast cancer may also have a tumor-associated PD-L1 expression. This could mean a new and effective treatment option for breast cancer patients with a positive PD-L1 state.  In the U.S., a monoclonal antibody therapy is already being tested in patients with advanced melanoma and other solid tumors (The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, USA).

Krebs stellt mit 13 % weltweit die häufigste Todesursache dar. Brustkrebs liegt mit 519 000 Todesfällen pro Jahr auf Platz 5 der häufigsten Krebsarten mit Todesfolge (WHO, Fact sheet N°297 February 2009). Aufgrund seiner hohen biologischen und genetischen Heterogenenität ist Brustkrebs ein Überbegriff für sehr unterschiedliche maligne Erkrankungen der Brustdrüse, was trotz histologischer und molekularbiologischer Tumorklassifikation zu deutlichen Unterschieden im Behandlungserfolg führt. Neben der Früherkennung als wichtigste Präventionsmaßnahme ist daher die Entwicklung von „maßgeschneiderten“ Therapien äußerst wichtig. Die Suche nach neuen Zielstrukturen, die Angriffspunkte für eine gezielte Bekämpfung von Tumorzellen darstellen, ist somit eine der Hauptaufgaben der modernen Krebsforschung. Dabei stellt die (Re-) Aktivierung der körpereigenen Immunabwehr einen vielversprechenden Ansatzpunkt dar. Ein geeignetes Tiermodell zur Analyse verschiedener Paramater zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Tumorprogression bietet das auf BALB/c-Hintergrund etablierte, induzierbare WAP-T- und WAP-T-NP-Mammakarzinom-Mausmodell. Bei den Mäusen kommt es während der Trächtigkeit und Laktation durch laktogene Hormone zur Aktivierung des gewebsspezifischen WAP-Promotors und damit zur Expression des Transgens in den Epithelzellen der murinen Brustdrüsen. Die Transgene exprimieren das SV40 T-Ag (WAP-T-Mauslinie) bzw. das SV40 T-Ag und das darin inserierte NP-Epitop des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) (WAP-T-NP8-Mauslinie). T-Ag transformiert Nagerzellen durch die Inaktivierung der Tumorsuppressorproteine pRb und p53 und ist daher ein Tumor-initiierendes Onkoprotein. Die sich entwickelnden intraepithelialen Neoplasien (mammary intraepithelial neoplasia, MIN) haben starke Ähnlichkeit mit humanen, duktalen in situ Karzinomen (ductal carcinoma in situ, DCIS). Das NP-Epitop von LCMV stellt für BALB/c-Mäuse ein stark immunogenes CTL-Epitop dar. Gegenüber T-Ag sind die transgenen Mäuse trotz der erst während der Trächtigkeit induzierten Expression des Transgens tolerant. Umso erstaunlicher ist es, dass WAP-T-NP8-Mäuse, ebenso wie wt BALB/c-Mäuse, zu einer LCMV-eliminierenden CTL-Antwort in der Lage sind. Das bedeutet, dass WAP-T-NP8-Tiere gegenüber dem NP-Epitop keine Toleranz aufweisen. Da die WAP-T-NP8-Mäuse im Vergleich zu WAP-T-Mäusen (fehlendes NP-Epitop) jedoch nach Induktion keine Unterschiede in der Tumorentwicklung zeigen, obwohl sie zu einer LCMV-eliminierenden CTL-Antwort in der Lage sind, bestand Unklarheit bezüglich der Immunkompetenz der WAP-T-NP8-Tiere gegenüber dem NP-Epitop. In dieser Arbeit wurde zunächst durch die vergleichenden Transplantationen von H8N8-Mammakarzinomzellen (Expression von T-Ag und NP-Epitop) in transgene WAP-T-NP8-, wt BALB/c- sowie CD 8-T-Zell-depletierten BALB/c-Mäusen die Effizienz der T-Zell-Antwort der verschiedenen Versuchsgruppen analysiert. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen waren eindeutig: während die CD 8-depletierten BALB/c- sowie die transgenen WAP-T-NP8-Mäuse nicht in der Lage waren, die Zellen abzustoßen und zu 100 % Tumore entwickelten, kam es in allen unbehandelten BALB/c-Mäusen zu einer Abstoßungsreaktion. Mit Hilfe der Ergebnisse der wt Tiere und der CD 8-depletierten BALB/c-Mäuse konnte gezeigt werden, wie wichtig eine effektive CTL-Reaktion für die Eliminierung der Tumorzellen ist. Des Weiteren konnten die Transplantationsexperimente bestätigen, dass das zusammen mit T-Ag präsentierte NP-Epitop von den transgenen Tieren nicht als körperfremd erkannt wird. Um zu klären, warum die WAP-T-NP8-Tiere zwar NP-Epitop-exprimierende, LCMV-infizierte Zellen erkennen und eliminieren, nicht aber T-Ag- und NP-Epitop-präsentierende Tumorzellen, wurde die erstmals bei der chronischen LCMV-Infektion beschriebene Expression von PD-L1 als möglicher Immune Escape-Mechanismus genauer analysiert. Dieses transmembranöse Oberflächenmolekül steht mit einer negativen Regulation der T-Zell-Antwort in Zusammenhang und wurde bereits für verschiedene chronische, humane Virusinfektionen (HIV, HBV, HCV) und auch für humane Krebsarten beschrieben. Zur Ermittlung des PD-L1-Status wurden die Mammakarzinomzellen (H8N8- und G-2-Zellen) sowie die daraus entstandenen Tumore und einige endogene WAP-T-NP8-Tumore mit Hilfe unterschiedlicher Methoden untersucht. Während H8N8- und G-2-Zellen in vitro als PD-L1-negativ einzustufen sind, konnten bei der Hälfte von 50 analysierten, endogenen Mammakarzinomen transgener WAP-T-NP-Mäuse immunhistologisch eine unterschiedlich starke PD-L1-Expression nachgewiesen werden. Dabei wurde eine deutliche Korrelation der Expressionsstärke von PD-L1 mit dem Differenzierungsgrad der Tumore (undifferenzierte G3- und G4-Karzinome) festgestellt. Durch den Einsatz weiterer Marker wurden die PD-L1-positiven Tumore genauer charakterisiert. Dabei wurde mit Hilfe von Doppelmarkierungen eine Unterscheidung von PD-L1-positiven Tumorzellen (PD-L1+/T-Ag+) und ebenfalls PD-L1-exprimierenden, Zytokeratin (CK)-negativen, Tumor-infiltrierenden Immunzellen (PD-L1+/CK 14- bzw. CK8/18-) vorgenommen, wobei Tumor-infiltrierende T-Zellen (CD 3) und Tumor-assoziierte Makrophagen (MAC 3) in der Immunhistochemie noch einmal gesondert beurteilt wurden. Anhand ihrer Zytokeratin-Expression konnten die PD-L1-positiven Zellen allerdings keiner bestimmten Tumorzell-Subpopulation zugeordnet werden. Es gab jedoch Hinweise darauf, dass stark PD-L1-exprimierende, undifferenzierte Karzinome im Vergleich zu schwach PD-L1-positiven, undifferenzierten Tumoren einen höheren Anteil an CK 14-positiven Zellen besitzen. Da sich die Expression von H8N8- und G-2-Zellen in Zellkultur durch Stimulation mit Interferon-gamma induzieren ließ, wurde die Vermutung, dass auch in vivo Interferon-gamma der entscheidende Parameter für die Expression von PD-L1 ist, durch einen weiteren, Interferon-sensitiven Oberflächenmarker (Sca-1) überprüft. Hierbei konnte in vitro und in vivo eine positive Korrelation zwischen der Sca-1- und der PD-L1-Expression festgestellt werden. Zusammenfassend machen die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse deutlich, wie effektiv das Immunsystem unter bestimmten Voraussetzungen gegen Tumorzellen vorgehen kann, aber auch, wie komplex seine Modulation und wie überaus wichtig die Erforschung dieser Komplexität für die Entwicklung neuer Immuntherapien ist.  Aufgrund der Ähnlichkeit des WAP-T-Mausmodells zur entsprechenden humanen Brustkrebserkrankung sowie einer bereits durchgeführten Analyse der PD-L1-Expression bei Patientinnen mit infiltrierendem, duktalem Karzinom (infiltrating ductal carcinoma, IDC)(Ghebeh et al., 2006), ist es sehr wahrscheinlich, dass auch andere humane Mammakarzinome eine Tumor-assoziierte PD-L1-Expression aufweisen. Für Brustkrebs-Patientinnen mit positivem PD-L1-Status könnte dies eine neue, zielgerichtete Therapiemöglichkeit bedeuten, die sich in den USA bereits als monoklonale Antikörpertherapie in der Erprobungsphase an Patienten mit fortgeschrittenen Melanomen und anderen soliden Tumoren befindet (The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Centre, USA).

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Wanger, Jara: Analyse der zellulären Immunantwort gegen SV40 T-Antigen-induzierte Mammakarzinome im transgenen Mausmodell. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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