Functional analysis of candidate regulatory genes in regulatory T cells

CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen (Tregs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Steuerung von Entzündungsprozessen, der Immunität von Tumoren und der Toleranz des Empfängers bei Transplantation. Anomalien in Tregs führen zu schweren Autoimmunerkrankungen beim Menschen sowie im Mausmodell. Foxp3 wurde als eines der wichtigsten regulatorischen Gene für die Entwicklung und Funktion von Tregs identifiziert. Allerdings wurden bislang nur sehr wenige Gene beschrieben, welche die Entwicklung und die Aktivität von Tregs kontrollieren. Die Identifizierung und Verifizierung neuer regulatorischer Gene der Homöostase, Aktivierung und Funktion von Tregs ist daher das Ziel der vorliegenden Arbeit. Als einen experimentellen Ansatz habe ich Genexpressionsanalysen in rekombinanten Inzucht-Mausstämmen durchgeführt, um expression Quantitative Trait Loci (eQTL) zu finden. Hierzu wurden ruhende periphere regulatorische T-Zellen aus 33 rekombinanten Maus Inzucht-Stämmen der BXD Familie isoliert. Bei der Transkriptionsanalyse der isolierten Tregs  wurden 14 trans-eQTL Banden gefunden, zwei trans-eQTL Banden wurden weitergehend untersucht und mögliche regulatorische Kandidatengene in den jeweiligen genomischen Abständen identifiziert. Außerdem studierte ich die Funktion des wichtigen potenziellen Gens PLAU. PLAU wurde zuvor mit Hilfe einer Trendkorrelationsanalyse des Transkriptoms aktivierter humaner Treg Zellen identifiziert. Hier konnte ich zeigen, dass PLAU für die Aktivierung humaner Treg spezifischer Genexpressionsmuster in der Zellkultur wichtig ist. PLAU wird in Tregs stärker exprimiert als in Effektor-T-Zellen (Teffs), nach Stimulation. Die Expression von PLAU konnte nach Transfektion mit PLAU-spezifischen small interfering RNA (siRNA) spezifischherunter reguliert werden. Am Tag 2 nach siRNA Transfektion war auch die Expression der Gene EOS und LGMN, am Tag 3 die Expression der Gene FOXP3, EOS und CTLA4 herunter reguliert. Diese Ergebnisse deuten auf eine sequentielle Regulation von anderen wichtigen Treg Genen durch PLAU hin. Außerdem konnte ich in meinen Studien zeigen, dass PLAU für Treg vermittelte suppressive Funktionen wichtig war. Tregs, welche PLAU auf einem höheren Niveau (PLAU-high Tregs) exprimierten, zeigten eine stärkere suppressive Aktivität gegenüber Teffs als Tregs mit geringer  PLAU-Expression (PLAU-low Tregs). Die Expression von PLAU, FOXP3, GARP, EOS, LGMN und CTLA4 war in PLAU-high Tregs deutlich höher als in PLAU-low Tregs. Die T-Helferzell-Zytokine IL13, IL5, IRF4, CSF2, STAT1, IL15, THFRSF8, THFRSF9, THFSF4 waren  in PLAU-high Tregs signifikant niedriger exprimiert, als in PLAU-low Tregs. Schließlich zeigten Studien an Mäusen, dass Plau für die Entwicklung von Tregs im Thymus erforderlich ist. Knockout-Mäuse, denen ein funktionales Plau Gen fehlte, hatten im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine signifikant niedrigere Anzahl von Foxp3+CD4+ Tregs im Thymus. Allerdings gab es keinen signifikanten Unterschied von Treg-Zellzahlen in den mesenterialen Lymphknoten, den peripheren Lymphknoten oder der Milz im Maus-Alter die wir studiert haben. Zusammenfassend konnte ich 14 trans-eQTL-Banden in naiven Treg-Zellen, welche wahrscheinlich viele andere Gene in Tregs regulieren können, identifizieren. Außerdem ist ein neuartiges wichtiges Gen, PLAU, gezeigt worden, um für die Wartung und Funktion von menschlichem Tregs in der Zellenkultur und für thymic Treg Entwicklung in Knock-Out-Mäusen wichtig zu sein.