Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Functional analysis of candidate regulatory genes in regulatory T cells

Chen, Hairong

CD4+CD25+ regulatory T cells (Tregs) play a critical role in controlling inflammation, tumor immunity and transplantation tolerance. Moreover, abnormalities in Tregs result in severe autoimmune disease in humans and in mouse models. Foxp3 has been identified as one of the key regulatory genes for Treg development and function. However, only very few genes that control the development and the suppressive function of Tregs have been described until now. Therefore, the aim of this thesis was to identify and verify novel regulatory genes for Treg maintenance, activation and function. As one experimental approach, I used gene expression analysis in recombinant inbred mouse strains to find expression Quantitative Traits loci (eQTL). Here, I analyzed the transcriptome of naïve peripheral regulatory T cells isolated from 33 BXD mouse recombinant inbred strains. 14 trans-eQTL bands were found, two trans-eQTL bands were further analyzed in detail and regulatory candidate genes in the respective genomic intervals were proposed. Furthermore, I studied the role of one potential important gene, PLAU, which was identified by a trend correlation analysis of the transcriptome from activated human Tregs. Here, I showed that PLAU is important for the activation of human Treg specific gene expression patterns in cell culture. First, PLAU was expressed at a higher level in Tregs than in effector T cells (Teffs) with stimulation. Second, transfection of short interference RNA targeting PLAU transcript downregulated the expression of PLAU in Tregs on day 1 after transfection, of EOS, LGMN on day 2, and of FOXP3, EOS, CTLA4 on day 3. These results suggest a sequential regulation of PLAU on other Treg key genes. I also showed that PLAU was important for Treg mediated suppressive function. Tregs that expressed PLAU at a higher level (PLAU-high Tregs) exhibited a stronger suppressive activity on Teffs than Tregs expressing lower level of PLAU (PLAU-low Tregs). The expression of PLAU, FOXP3, GARP, EOS, LGMN and CTLA4 was higher in PLAU-high Tregs compared to PLAU-low Tregs. The T helper cytokines IL13, IL5, IRF4, CSF2, STAT1, IL15, TNFRSF8, TNFRSF9 and TNFSF4 were significantly lower expressed in PLAU-high Tregs compared to PLAU-low Tregs. Finally, studies in mice showed that Plau is required for the development of Tregs in the thymus. Knockout mice which were lacking a functional PLAU gene had significantly lower frequency of Foxp3+CD4+ Tregs in the thymus compared to wild type mice. However, there was no significant difference of Treg cell frequency in the mesenteric lymph nodes, peripheral lymph nodes or spleen at the mice age we studied. In conclusion, I identified 14 trans-eQTL bands in naïve Treg cells which may regulate many other genes in Tregs. Two trans-eQTL bands were supported by gene expression analysis. In addition, one novel important gene, PLAU, has been shown to be important for maintenance and function of human Tregs in cell culture and for thymic Treg development in knockout mice.

CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen (Tregs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Steuerung von Entzündungsprozessen, der Immunität von Tumoren und der Toleranz des Empfängers bei Transplantation. Anomalien in Tregs führen zu schweren Autoimmunerkrankungen beim Menschen sowie im Mausmodell. Foxp3 wurde als eines der wichtigsten regulatorischen Gene für die Entwicklung und Funktion von Tregs identifiziert. Allerdings wurden bislang nur sehr wenige Gene beschrieben, welche die Entwicklung und die Aktivität von Tregs kontrollieren. Die Identifizierung und Verifizierung neuer regulatorischer Gene der Homöostase, Aktivierung und Funktion von Tregs ist daher das Ziel der vorliegenden Arbeit. Als einen experimentellen Ansatz habe ich Genexpressionsanalysen in rekombinanten Inzucht-Mausstämmen durchgeführt, um expression Quantitative Trait Loci (eQTL) zu finden. Hierzu wurden ruhende periphere regulatorische T-Zellen aus 33 rekombinanten Maus Inzucht-Stämmen der BXD Familie isoliert. Bei der Transkriptionsanalyse der isolierten Tregs  wurden 14 trans-eQTL Banden gefunden, zwei trans-eQTL Banden wurden weitergehend untersucht und mögliche regulatorische Kandidatengene in den jeweiligen genomischen Abständen identifiziert. Außerdem studierte ich die Funktion des wichtigen potenziellen Gens PLAU. PLAU wurde zuvor mit Hilfe einer Trendkorrelationsanalyse des Transkriptoms aktivierter humaner Treg Zellen identifiziert. Hier konnte ich zeigen, dass PLAU für die Aktivierung humaner Treg spezifischer Genexpressionsmuster in der Zellkultur wichtig ist. PLAU wird in Tregs stärker exprimiert als in Effektor-T-Zellen (Teffs), nach Stimulation. Die Expression von PLAU konnte nach Transfektion mit PLAU-spezifischen small interfering RNA (siRNA) spezifischherunter reguliert werden. Am Tag 2 nach siRNA Transfektion war auch die Expression der Gene EOS und LGMN, am Tag 3 die Expression der Gene FOXP3, EOS und CTLA4 herunter reguliert. Diese Ergebnisse deuten auf eine sequentielle Regulation von anderen wichtigen Treg Genen durch PLAU hin. Außerdem konnte ich in meinen Studien zeigen, dass PLAU für Treg vermittelte suppressive Funktionen wichtig war. Tregs, welche PLAU auf einem höheren Niveau (PLAU-high Tregs) exprimierten, zeigten eine stärkere suppressive Aktivität gegenüber Teffs als Tregs mit geringer  PLAU-Expression (PLAU-low Tregs). Die Expression von PLAU, FOXP3, GARP, EOS, LGMN und CTLA4 war in PLAU-high Tregs deutlich höher als in PLAU-low Tregs. Die T-Helferzell-Zytokine IL13, IL5, IRF4, CSF2, STAT1, IL15, THFRSF8, THFRSF9, THFSF4 waren  in PLAU-high Tregs signifikant niedriger exprimiert, als in PLAU-low Tregs. Schließlich zeigten Studien an Mäusen, dass Plau für die Entwicklung von Tregs im Thymus erforderlich ist. Knockout-Mäuse, denen ein funktionales Plau Gen fehlte, hatten im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine signifikant niedrigere Anzahl von Foxp3+CD4+ Tregs im Thymus. Allerdings gab es keinen signifikanten Unterschied von Treg-Zellzahlen in den mesenterialen Lymphknoten, den peripheren Lymphknoten oder der Milz im Maus-Alter die wir studiert haben. Zusammenfassend konnte ich 14 trans-eQTL-Banden in naiven Treg-Zellen, welche wahrscheinlich viele andere Gene in Tregs regulieren können, identifizieren. Außerdem ist ein neuartiges wichtiges Gen, PLAU, gezeigt worden, um für die Wartung und Funktion von menschlichem Tregs in der Zellenkultur und für thymic Treg Entwicklung in Knock-Out-Mäusen wichtig zu sein.

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Chen, Hairong: Functional analysis of candidate regulatory genes in regulatory T cells. Hannover 2011. Tierärztliche Hochschule.

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