Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Effects of cryopreservation on osmotic membrane properties, intracellular ion distribution, and ion channels of bovine sperm

Blässe, Anne-Kathrin

Cryopreserved bovine sperm are predominantly used for artificial insemination (AI) in dairy cattle breeding. After cryopreservation, however, considerable losses are observed in sperm viability. Damage during cryopreservation has been attributed to the severe osmotic stresses that the cells are exposed to during freezing and thawing. The aims of this study were: (1) to compare osmotic tolerance limits and volume response of bovine sperm before and after cryopreservation, (2) to determine the intracellular H+ and K+ concentration of bovine sperm before and after cryopreservation, and (3) to identify the expression of K+ and Cl- ion channels, putatively involved in sperm volume regulation. This study will provide information about mechanisms that result in damage on bovine sperm during cryopreservation. These results will be useful to optimize freezing and thawing conditions to increase sperm survival after cryopreservation. Performing a flow cytometric analysis of propidium iodide stained (plasma membrane intact) bovine sperm, this study showed that the critical osmolality, at which 50 % of sperm survive exposure to hypotonic stress, was increased from 55 mOsm/kg for extended bovine sperm to 89 mOsm/kg for cryopreserved bovine sperm. This indicates that cryopreservation decreases the hypotonic tolerance of bovine sperm. Simultaneous measurement of the cell volume and viability using flow cytometry showed that the volume response upon exposure to anisotonic conditions was similar for plasma membrane intact extended and cryopreserved bovine sperm. These experiments pointed out that bovine sperm that survive cryopreservation exhibit a similar volume response as before cryopreservation. The osmotic inactive volume Vb of extended and cryopreserved bovine sperm was determined to be 70 % of the isotonic cell volume. The effects of cryopreservation on the intracellular pH and intracellular K+ concentration were determined using a fluorometric analysis of bovine sperm loaded with carboxyfluorescein (CF). CF fluorescence is dependent on the pH. The intracellular pH was determined by recording changes in CF fluorescence of sperm resuspended in buffers with different pH before and after digitonin addition. It was found that the intracellular pH of bovine sperm decreased from 6.28 before cryopreservation to 6.16 after cryopreservation, indicative for an increase in intracellular H+. Using the K+ ionophore nigericin and incubation of bovine sperm in media with various K+ concentrations, the intracellular K+ concentration was found to increase from 154 mM for extended bovine sperm to 183 mM for cryopreserved bovine sperm. Expressions of the Cl- ion channel CLC-3 and the K+ ion channels TASK-2 and Kv1.5, which are suggested to be involved in sperm volume regulation, were detected in bovine sperm. Gene transcripts of CLC-3, TASK-2, and Kv1.5 were amplified by nested PCR and confirmed by nucleotide sequencing. Western blot experiments were performed to confirm protein e-pression of these ion channels. Specific signals were obtained for CLC-3 at about 72 kDa and for TASK-2 at about 55 and 60 kDa. A weaker signal was obtained for Kv1.5 at about 60 kDa. Expression of these proteins was not affected by cryopreservation. Immunolocalization experiments indicated that CLC-3 was localized in the midpiece and the upper and lower tail of bovine sperm, both for sperm exposed to isotonic and hypotonic conditions. This study shows that tolerance of the plasma membrane to hypotonic conditions is important for survival of bovine sperm after cryopreservation. Furthermore, cryopreservation alters mechanisms that maintaining intracellular H+ and K+ concentrations. In contrast, osmotic volume response and expression of the ion channels CLC-3, TASK-2, and Kv1.5 are unaffected by cryopreservation.

Die Rinderzucht beruht fast ausschließlich auf der Verwendung von kryokonservierten Bullenspermien und der künstlichen Befruchtung. Allerdings ist ein erheblicher Teil der Spermien nach der Kryokonservierung nicht vital. Schäden bei der Kryokonservierung entstehen vor allem durch starke osmotische Veränderungen, denen die Spermien während des Einfrierens und des Auftauens ausgesetzt sind. Die Ziele dieser Studie waren: (1) ein Vergleich der osmotischen Membrantoleranz und des Volumenverhaltens von bovinen Spermien vor und nach der Kryokonservierung, (2) die Untersuchung der intrazellularen H+- und K+-Konzentrationen vor und nach der Kryokonservierung, sowie (3) die Identifizierung von K+- und Cl--Ionenkanälen, die mutmaßlich an der Volumenregulation von Spermien beteiligt sind. Diese Studie wird weiterführende Informationen über die Schäden an Bullenspermien liefern, die durch die Kryokonservierung entstehen. Durch die Ergebnisse können Einfier- und Auftaubedingungen optimiert werden, um so die Überlebensrate boviner Spermien nach der Kryokonservierung zu erhöhen. Mittels einer flowzytometrischen Analyse von Propidium Iodid gefärbten (Plasmamembran intakten) bovinen Spermien, wurde in dieser Studie gezeigt, dass die kritische Osmolalität, bei der 50 % der Spermien hypotonen Stress überleben, von 55 mOsm/kg für verdünnte Spermien auf 89 mOsm/kg für kryokonservierte Spermien anstieg. Dieses zeigt, dass die hypotone Toleranz von bovinen Spermien durch die Kryokonservierung stark verringert wird. Simultane Messungen des Zellvolumens und der Vitalität boviner Spermien mittels Flowzytometrie zeigten, dass das Volumenverhalten unter anisotonischen Bedingungen für Plasmamembran intakte verdünnte und kryokonservierte Spermien gleich war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass bovine Spermien, welche die Kryokonservierung überleben, uneingeschränkt in ihrem osmotischen Zellvolumenverhalten sind. Das osmotisch inaktive Zellvolumen für verdünnte und kryokonservierte Bullenspermien war 70 %. Einen Einfluss der Kryokonservierung auf den intrazellulären pH und die K+-Konzentration wurde mittels einer fluorometrischen Analyse von Carboxyfluorescein(CF)-beladenen bovinen Spermien untersucht. Hierbei wurde die pH-Abhängigkeit der CF-Fluoreszenz ausgenutzt. Der intrazelluläre pH-Wert wurde anhand der Änderungen der CF-Fluoreszenz von Spermien in Lösungen verschiedener pH-Werte vor und nach einer Zugabe von Digitonin bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass der intrazelluläre pH von Bullenspermien von 6.28 vor der Kryokonservierung auf 6.16 nach der Kryokonservierung abfiel, was auf einen Anstieg der intrazellulären H+-Konzentration hindeutet. Unter Verwendung des K+-Ionophors Nigericin und boviner Spermien in Medien mit verschiedenen K+-Konzentrationen, wurde ein Anstieg der intrazellulären K+-Konzentration von 154 mM in verdünnten Spermien auf 183 mM in kryokonservierten Spermien festgestellt. Die Expressionen des Cl--Ionenkanals CLC-3 und der beiden K+-Ionenkanäle TASK-2 und Kv1.5 in bovinen Spermien, Ionenkänale die sehr wahrscheinlich an der Volumenregulation von Spermien beteiligt sind, wurden in dieser Studie nachgewiesen. Gentranskripte von CLC-3, TASK-2 und Kv1.5 wurden mittels Nested-PCR amplifiziert und mittels Nukleotid-Sequenzierung bestätigt. Western Blot-Versuche bestätigten die Expression der Proteine dieser Ionenkanäle in Bullenspermien. Es konnten spezifische Banden für CLC-3 bei ca. 72 kDa und für TASK-2 bei ca. 55 und 60 kDa nachgewiesen werden. Eine schwächere Bande wurde für Kv1.5 bei 60 kDa erhalten. Die Expression dieser Ionenkanäle wurde durch die Kryokonservierung nicht verändert. Mittels Immunlokalisation wurde CLC-3 im Mittelstück sowie am Flagellumansatz und -ende boviner Spermien detektiert, sowohl unter isotonen als auch hypotonen Bedingungen. Diese Arbeit zeigt, dass die Toleranz der Plasmamembran von bovinen Spermien unter hypotonen Bedingungen wichtig für das Überleben der Spermien während der Kryokonservierung ist. Zudem werden durch die Kryokonservierung Mechanismen verändert, welche die intrazellulären H+- und K+-Konzentrationen aufrechterhalten. Im Gegensatz dazu, bleiben das osmotischen Zellvolumenverhalten sowie die Expression der Ionenkanäle CLC-3, TASK-2 und Kv1.5 von der Kryokonservierung unbeeinträchtigt.

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Blässe, Anne-Kathrin: Effects of cryopreservation on osmotic membrane properties, intracellular ion distribution, and ion channels of bovine sperm. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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