Effects of cryopreservation on osmotic membrane properties, intracellular ion distribution, and ion channels of bovine sperm

Die Rinderzucht beruht fast ausschließlich auf der Verwendung von kryokonservierten Bullenspermien und der künstlichen Befruchtung. Allerdings ist ein erheblicher Teil der Spermien nach der Kryokonservierung nicht vital. Schäden bei der Kryokonservierung entstehen vor allem durch starke osmotische Veränderungen, denen die Spermien während des Einfrierens und des Auftauens ausgesetzt sind. Die Ziele dieser Studie waren: (1) ein Vergleich der osmotischen Membrantoleranz und des Volumenverhaltens von bovinen Spermien vor und nach der Kryokonservierung, (2) die Untersuchung der intrazellularen H+- und K+-Konzentrationen vor und nach der Kryokonservierung, sowie (3) die Identifizierung von K+- und Cl--Ionenkanälen, die mutmaßlich an der Volumenregulation von Spermien beteiligt sind. Diese Studie wird weiterführende Informationen über die Schäden an Bullenspermien liefern, die durch die Kryokonservierung entstehen. Durch die Ergebnisse können Einfier- und Auftaubedingungen optimiert werden, um so die Überlebensrate boviner Spermien nach der Kryokonservierung zu erhöhen. Mittels einer flowzytometrischen Analyse von Propidium Iodid gefärbten (Plasmamembran intakten) bovinen Spermien, wurde in dieser Studie gezeigt, dass die kritische Osmolalität, bei der 50 % der Spermien hypotonen Stress überleben, von 55 mOsm/kg für verdünnte Spermien auf 89 mOsm/kg für kryokonservierte Spermien anstieg. Dieses zeigt, dass die hypotone Toleranz von bovinen Spermien durch die Kryokonservierung stark verringert wird. Simultane Messungen des Zellvolumens und der Vitalität boviner Spermien mittels Flowzytometrie zeigten, dass das Volumenverhalten unter anisotonischen Bedingungen für Plasmamembran intakte verdünnte und kryokonservierte Spermien gleich war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass bovine Spermien, welche die Kryokonservierung überleben, uneingeschränkt in ihrem osmotischen Zellvolumenverhalten sind. Das osmotisch inaktive Zellvolumen für verdünnte und kryokonservierte Bullenspermien war 70 %. Einen Einfluss der Kryokonservierung auf den intrazellulären pH und die K+-Konzentration wurde mittels einer fluorometrischen Analyse von Carboxyfluorescein(CF)-beladenen bovinen Spermien untersucht. Hierbei wurde die pH-Abhängigkeit der CF-Fluoreszenz ausgenutzt. Der intrazelluläre pH-Wert wurde anhand der Änderungen der CF-Fluoreszenz von Spermien in Lösungen verschiedener pH-Werte vor und nach einer Zugabe von Digitonin bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass der intrazelluläre pH von Bullenspermien von 6.28 vor der Kryokonservierung auf 6.16 nach der Kryokonservierung abfiel, was auf einen Anstieg der intrazellulären H+-Konzentration hindeutet. Unter Verwendung des K+-Ionophors Nigericin und boviner Spermien in Medien mit verschiedenen K+-Konzentrationen, wurde ein Anstieg der intrazellulären K+-Konzentration von 154 mM in verdünnten Spermien auf 183 mM in kryokonservierten Spermien festgestellt. Die Expressionen des Cl--Ionenkanals CLC-3 und der beiden K+-Ionenkanäle TASK-2 und Kv1.5 in bovinen Spermien, Ionenkänale die sehr wahrscheinlich an der Volumenregulation von Spermien beteiligt sind, wurden in dieser Studie nachgewiesen. Gentranskripte von CLC-3, TASK-2 und Kv1.5 wurden mittels Nested-PCR amplifiziert und mittels Nukleotid-Sequenzierung bestätigt. Western Blot-Versuche bestätigten die Expression der Proteine dieser Ionenkanäle in Bullenspermien. Es konnten spezifische Banden für CLC-3 bei ca. 72 kDa und für TASK-2 bei ca. 55 und 60 kDa nachgewiesen werden. Eine schwächere Bande wurde für Kv1.5 bei 60 kDa erhalten. Die Expression dieser Ionenkanäle wurde durch die Kryokonservierung nicht verändert. Mittels Immunlokalisation wurde CLC-3 im Mittelstück sowie am Flagellumansatz und -ende boviner Spermien detektiert, sowohl unter isotonen als auch hypotonen Bedingungen. Diese Arbeit zeigt, dass die Toleranz der Plasmamembran von bovinen Spermien unter hypotonen Bedingungen wichtig für das Überleben der Spermien während der Kryokonservierung ist. Zudem werden durch die Kryokonservierung Mechanismen verändert, welche die intrazellulären H+- und K+-Konzentrationen aufrechterhalten. Im Gegensatz dazu, bleiben das osmotischen Zellvolumenverhalten sowie die Expression der Ionenkanäle CLC-3, TASK-2 und Kv1.5 von der Kryokonservierung unbeeinträchtigt.