Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Immunhistologische Untersuchung ausgewählter Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und deren Inhibitoren in der neoplastisch veränderten Mamma und den assoziierten Lymphknoten von Hunden

Bornbaum, Julia

Following the literature section, addressing the morphology, epidemiology, etiology and pathogenetic factors of canine mammary tumours, the experimental design including the study groups is described. These groups include simple adenomas (n= 15) and complex adenomas (n= 19), benign mixed mammary tumours (n= 15), simple carcinomas (n= 19) and complex carcinomas (n= 17) and also physiological (n= 9) and hyperplastic tissues (n= 7). The paraffin sections were immunohistochemically investigated for MMP-7, MMP-11, MMP-12 and TIMP-3 in various structures and localisations. Therefore the avidin-biotin-peroxidase-complex-technique was used (performed by Dr. Vanja Paltian). For MMP-7 and MMP-12 there were applied polyclonal rabbit-anti-human-primary-antibodies and a biotinylated goat-anti-rabbit-secondary-antibody. For MMP-11 and TIMP-3 there were used monoclonal Mouse-anti-human-primary-antibodies and a biotinylated horse-anti-mouse-secondary-antibody. MMP-7: The analysis of the MMP-7 signal for all investigation groups depicted five outstanding structures: the myoepithelial cells, the inflammatory cells, the stromal cells and the blood vessel components “endothelial cells” and “media”. These structures showed the strongest immunohistological signal for MMP-7 in the group of complex adenomas and they were significantly or highly significantly different to the other investigation groups. This finding is in accordance to the literature, where the high expression level of the MMP-7 in stromal cells was also found, dependent on their distance to mammary tumours. This was explained by the induction of MMP-7 expression in stromal cells by tumour cells. The present study confirms these results. It is also well known, that stromal cells influence the expression of MMPs by tumour cells due to paracrine secretion of growth factors and cytokines. Therefore the high MMP-7 expression level of the complex adenomas in this study could maybe explained by induction by cells of the well organized activated stromal cells and capsule. This could be verified in further studies. MMP-11: The group of the benign mixed mammary tumours with its very distinct MMP-11 expression was highly significantly different to the other investigation groups. The alveolar und ductal epithelial cells, the myoepithelial and inflammatory cells, the cortex of the lymph nodes, the endothelial cells of the vessels and the stromal cells showed these outstanding differences in MMP-11 expression. In the vicinity of the tumour and distant to the tumour the benign mixed mammary tumours showed (highly-) significant expression differences in MMP-11 expression in endothelial and stromal cells compared to the other investigation groups. The benign mixed tumors were strongly MMP-11 positive in both localisations of these structures. For the epithelial and inflammatory cells, the strongest MMP-11 signal was depicted in the physiological mamma, followed by the periphery and centre of the tumour. In all tumour groups, especially the benign mixed tumours, there was a higher expression level in epithelial cells compared to the same cell population of the control group. This result was confirmed by others, who found a higher MMP-11 expression in tumour cells than in normal mammary tissue. The prominent expression in this study within metastasized lymph nodes of the simple carcinomas is according to publications describing MMP-11 expression in breast carcinomas with metastatic potential. The outstanding expression in benign mixed tumours is a surprising and not yet published result. There should be further investigations to clear a possible correlation between the expression of MMP-11 and this tumour type. MMP-12: the evaluation of the MMP-12 signal for all investigation groups showed six outstanding structures: the alveolar and myoepithelial cells, the inflammatory cells, the cortex and medulla of the associated lymph nodes and the media of the vessels. The highest MMP-12 level in these structures was found in the groups of the simple carcinomas and the benign mixed tumours. Their expression was highly significantly different to the weaker MMP-12 signals of the other investigated groups. In literature, the MMP-12 expression is associated with tumour associated macrophages, so called TAMs, which are correlated with decreased survival, tumour cell proliferation, angiogenesis in malignant mammary tumours and metastasis. Our results suggest this, as the inflammatory cells in metastasising simple carcinomas showed the highest MMP-12 expression. The control group displayed the strongest MMP-12 expression in the vessel media of all groups. It is known, that MMP-12 can influence the angiogenesis, but an outstanding expression level in the media of blood vessels is not described. A correlation between the MMP-12 signal in the media and angiogenesis is possible, but not proved. TIMP-3: The statistical evaluation for the immunohistological TIMP-3 signal showed highly significant or significant values for the alveolar, ductal and myoepithelial cells, the inflammatory cells, and the media of the vessels of the tumour groups. All tumour groups, but especially the simple carcinomas showed distinct signals for TIMP-3, whereas the control group expressed only weakly. In inflammatory cells, the simple carcinomas showed the highest TIMP-3 expression level. This is according to publications, which found prominent TIMP-3 signals in inflammatory cells within the tumour. Similarly to human studies, the canine mammary tumours seemed to be accompanied by inflammatory cells expressing TIMP-3. In general, in our study there is more TIMP-3 expression in malignant than in benign tumours. This may be due to the inhibitory effect of the enzyme. Thus the highest TIMP-3 values were found in the tumour periphery, the area of tumour growth. In conclusion, in canine mammary tumours the MMP and TIMP expression varies in localizations and structures. A correlation with the tumour type is possible. There should be further studies on canine samples to clear the possibilities of using MMPs or TIMPs in clinical tests or even therapies.

Die Literaturübersicht widmet sich dem morphologischen Aufbau der kaninen Milchdrüse, der Epidemiologie, Ätiologie und Pathogenese von Mammatumoren der Hündin und teilt die Tumorarten anhand der WHO-Klassifikation ein. Die extrazelluläre Matrix wird kurz in Aufbau und Funktion beschrieben und die Matrixmetalloproteinasen und deren Inhibitoren (MMP-7, MMP-11, MMP-12, TIMP-3) anhand von Klassifikation, Funktion und Aufbau zuerst allgemein, dann im Speziellen vorgestellt. Auch die Regulation und die Substrate der MMPs werden thematisiert und der Einfluss dieser Enzyme auf Tumoren behandelt. Ihre Expression in physiologischem und pathologischem Gewebe von Mensch und Hund, vor allem in der Milchdrüse wird dargelegt. Zur Kategorisierung des Untersuchungsmaterials wurden formalinfixierte, parafineingebettete und H.-E.-gefärbte Schnittpräparate der kaninen Mamma mikroskopisch gesichtet und in folgende Gruppen unterteilt: Kontrollgruppe (n= 9), Hyperplasiegruppe (n= 7), komplexe Adenome (n= 19), einfache Adenome (n= 15), benigne Mischtumoren (n= 15), komplexe Karzinome (n= 17) und einfache Karzinome (n= 19). Die immunhistologische Darstellung der Antigene wurde mit der Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Methode durchgeführt (Durchführung: Dr. Vanja Paltian). Dabei wurden für MMP-7 und MMP-12 polyklonale Kaninchen-anti-Mensch-Primärantikörper und ein biotinilierter Ziege-anti-Kaninchen-Sekundärantikörper verwendet. Für MMP-11 und TIMP-3 wurden monoklonale Maus-anti-Mensch-Primärantikörper, sowie ein biotiniliertes Pferd-anti-Maus-Immunglobulin als Sekundärantikörper eingesetzt. Die immunhistologisch behandelten Präparate wurden qualitativ und semiquantitativ erfasst und statistisch ausgewertet. MMP-7: Bei der Auswertung des Matrilysin-Signals über alle Untersuchungsgruppen waren statistisch 5 Strukturen auffallend: das Myoepithel, die Entzündungszellen, das Stroma und die Gefäßbestandteile Endothel und Media. Die genannten Strukturen unterschieden sich in ihrem MMP-7-Signal besonders in der Gruppe der komplexen Adenome, die am deutlichsten exprimierte, signifikant oder hochsignifikant von den übrigen Untersuchungsgruppen. Möglicherweise ist die signifikant erhöhte MMP-7-Expression des Stromas auf die Induktion durch Tumorzellen zurückzuführen, wie dies in der Literatur bereits für MMP-7 beschrieben wurde. Zusätzlich wird die MMP-7-Produktion in Epithelien des Tumors durch stromale Zellen reguliert. Ob die erhöhten MMP-7-Werte der komplexen Adenome durch aktivierte mesenchymale Zellen im Tumor und in der deutlich ausgeprägten Kapsel mit verursacht werden, bleibt ungeklärt, geben jedoch möglicherweise Anlass zu weiteren Untersuchungen. MMP-11: Beim immunhistologischen Nachweis von MMP-11 war die Gruppe der benignen Mammamischtumoren mit ihrer sehr deutlichen MMP-11-Expression zum Teil hochsignifikant verschieden zu den anderen Untersuchungsgruppen. Diese herausragenden Signalunterschiede betrafen die folgende Strukturen: das alveoläre und das duktale Epithel, das Myoepithel, die Entzündungszellen, die Lymphknotenrinde, das Gefäßendothel und das Stroma. Die Lokalisationsvergleiche zwischen dem physiologischen umgebenden Gewebe, dem Tumorzentrum und der Tumorperipherie waren über alle Untersuchungsgruppen für die alveolären und duktalen Epithelien, das Myoepithel und die Entzündungszellen zum Teil hochsignifikant, zum Teil signifikant unterschiedlich. Dabei zeigten stets die benignen Mischtumoren das stärkste MMP-11-Signal im Vergleich zu den anderen Untersuchungsgruppen. Das deutlichste Stromelysin-3-Signal wies die physiologische Mamma auf, gefolgt von der Tumorperipherie und dem Tumorzentrum. In allen Tumorgruppen, besonders aber bei den benignen Mischtumoren konnte in den Epithelien mehr MMP-11-Expression nachgewiesen werden, als in den Epithelien der Kontrollgruppe. Dieses Verteilungsmuster ist auch in der Literatur zu finden. Die deutliche MMP-11-Expression in den metastasierten Lymphknoten der einfachen Karzinome deckt sich mit Publikationen, die MMP-11 vor allem in Brusttumoren mit metastatischem Potential nachgewiesen haben. Die vorgefundene auffallend starke Expression in benignen Mischtumoren der Hündin stellt ein überraschendes und in der Literatur bislang noch nicht beschriebenes Ergebnis dar und die Bedeutung der MMP-11-Reaktion in dieser Tumorart bleibt unklar. Möglicherweise könnten weitere Untersuchungen Korrelationen zwischen der Expression dieses MMPs und den benignen Mischtumoren beleuchten. MMP-12: Bei der Auswertung des MMP-12-Signals über alle Untersuchungsgruppen waren statistisch 6 Strukturen auffallend: das alveoläre Epithel, das Myoepithel, die Entzündungszellen, die Rinde und das Mark der assoziierten Lymphknoten und die Gefäßmedia. Die höchsten MMP-12-Level wurden in diesen Strukturen in den Gruppen der einfachen Karzinome und der benignen Mischtumoren nachgewiesen. Diese unterschieden sich zum Teil hochsignifikant von der weitaus geringeren MMP-12-Expression der übrigen Untersuchungsgruppen. In der Literatur wird die Expression von MMP-12 in Verbindung mit tumorassoziierten Makrophagen, den sogenannten TAMs beschrieben, die mit geringerer Überlebensspanne, der Tumorzellproliferation, Angiogenese und Metastasierung in Verbindung gebracht werden. Die vorliegende Studie unterstützt diese Ergebnisse, da für die Entzündungszellen die stärkste MMP-12-Expression in den metastasierten einfachen Karzinomen gefunden wurde. Eine Besonderheit wurde bei der statistischen Auswertung der Kontrollgruppe festgestellt, deren Gefäßmedia die stärkste MMP-12-Expression aller Untersuchungsgruppen in dieser Struktur zeigte. Die Makrophagen-Elastase beeinflusst die Angiogenese. Allerdings ist die deutliche Expression in der Gefäßmedia bislang in der Literatur nicht beschrieben. Ob die in dieser Arbeit ermittelte MMP-12-Expression der Gefäßmedia einen Einfluss auf die Angiogenese hat, kann vermutet werden, bleibt jedoch zu klären. TIMP-3: Die statistische Auswertung des immunhistologischen Signals für TIMP-3 ergab in folgenden Strukturen hochsignifikante, beziehungsweise signifikante Expressionsunterschiede zwischen den Untersuchungsgruppen: im alveolären Epithel, im duktalen Epithel, im Myoepithel, in den Entzündungszellen und der Gefäßmedia. Dabei exprimierten alle Tumorgruppen, besonders jedoch die einfachen Karzinome sehr deutlich TIMP-3, wohingegen die Kontrollgruppe in allen Strukturen nur ein schwaches Signal aufwies. Die einfachen Karzinome zeigten in den Entzündungszellen das deutlichste TIMP-3-Signal aller Untersuchungsgruppen. Diese Ergebnisse stimmen mit Untersuchungen überein, die TIMP-3 vor allem in inflammatorischen Zellen im Tumor gefunden haben. Es scheinen auch bei der Hündin (wie bei humanen Brusttumoren) Neoplasien der Mamma von Entzündungszellen begleitet zu sein, die TIMP-3 exprimieren. Generell wurde in der vorliegenden Arbeit mehr TIMP-3 in malignen als in benignen Tumoren detektiert. Diese Verteilung und die hohen Expressionswerte des Enzyms in der Tumorperipherie, dem Bereich des Tumorwachstums, könnten mit dem inhibitorischen Effekt des Enzyms erklärbar sein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass kanine Mammatumoren in der MMP- und TIMP-Expression in verschiedenen Strukturen und Lokalisationen von Tumoren variieren. Eine Zuordnung verschiedener MMPs zu bestimmten Tumoren, Dignitäten und Strukturen ist möglich. Möglicherweise könnten weitere Studien an veterinärmedizinischem Untersuchungsmaterial die Eignung dieser Enzyme für klinische Tests oder auch Therapien klären.

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Bornbaum, Julia: Immunhistologische Untersuchung ausgewählter Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und deren Inhibitoren in der neoplastisch veränderten Mamma und den assoziierten Lymphknoten von Hunden. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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