Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Bildung von Thiamin und seinen Thiaminphosphorsäureestern in Getreide während des Pflanzenwachstums, in diversen Hefen und der Abbau während der Fleischreifung

Buchholz, Martina

In the present paper thiamine, and its thiamine phosphates thiamine monophosphate, thiamine diphosphate and thiamine triphosphate were analysed in the grain species wheat (Triticum aestivum, Dekan), rye (Secale cereale, Agronom), triticale (Triticosecale, SW Talentro), oat (Avena sativa, Dominik) and barley (Hordeum vulgare, Merlot). The analyses were performed during the corn formation phase at different development stages from the beginning of the spike development to the mature grain. Furthermore analyses in various yeasts of the genus Saccharomyces cerevisiae like fresh bakery yeast, dry bakery yeast, fresh brewer´s yeast and brewer´s yeast flakes were performed.  For the determination in fresh pork meat (30 min post mortem) as well as during storage for up to 9 days (216 h) a modified enzymatic digestion was performed in parallel for the same pork meat sample. This method led to improved results compared to the § 64 LFGB method. For the simultaneous determination of thiamine and thiamine phosphates a newly developed solid phase extraction and a new HPLC method were used. The application of these new methods it was possible for the first time a concurrent purification of thiamine and thiamine phosphates in complex grain matrices as well as in yeast and pork meat matrices. For the solid phase extraction a C-18-Säule was combined with a SAX-column and for the HPLC method a C-8-column was combined with a NH2 column. These combinations result in a reversed sequence of retention. Due to this thiochrome is retarded as first substance and the higher thiochrome phosphates are visible in the chromatogram without interfering peaks. The limit of detection for thiamine is 0.3 ng/mL, for thiamine monophosphate 0.5 ng/mL and for thiamine diphosphate it is 0.9 ng/mL. In triticale, oat, barley, wheat and rye the thiamine and thiamine phosphate contents were analysed at different times during the ripening. In all analysed samples no thiamine triphosphate was detect. Only thiamine, thiamine monophosphate and thiamine diphosphate in different concentrations were determined in the grain samples. The course and spreading of the thiamine compounds were similar in all grain species. In all grain samples a certain percentage of thiamine diphosphate is present at the beginning, which is declining during the ripening of the corn. This percentage varies between 16,5 % in triticale and 46,9 % in oat. Thiamine phosphate is present at a percentage of 1,2 % in barley up to 13,6 % in oat at the beginning of the analyses. At the end of the analyses nearly only free thiamine with a percentage of 97 % on average was present in all grain species. A minor percentage of thiamine phosphate is still present in some cases. Thiamine monophosphate could not be detected any more at the ripeness of the grains. A specific characteristic could be shown for rye and wheat during the growth and ripening. An anew synthesis of thiamine monophosphate happened for wheat at a solids content of 56,79 % and for rye at a solids content of 87,85 %. Typically the ripe corn passes over to the stadium of dormancy and mobilizes the resources during the next germination. At this point in time climatic conditions must have been present which influenced this process and initiate the synthesis of thiamine monophosphate in the grain plant. The relevance of thiamine monophosphate for the metabolism is not definitely clarified yet. Probably it is like in the animal organism a precursor molecule for the synthesis of thiamine and thiamine diphosphate which is a coenzyme.  It can be summarized that the new methods for thiamine analysis can as well reliably be used for the analysis of thiamine compounds in a variety of grain species. A decrease of the thiamine content like in pork meat during the alteration of the phosphorylation level was not observed in grains.  The total thiamine content was nearly constant (with slight deviations) during the growth of the grains related to dry solids. Only in triticale a reduction of the thiamine content during the ripening was detected. With this method it was possible for the first time to establish a sum of the developing thiamine compounds in grain.   In yeasts the developed method for the analysis of thiamine resulted in a good separation of the thiamine compounds from the complex matrix of the samples. The determination of the thiamine compounds was possible within a short duration. The thiamine content in fresh bakery yeast was 10 times higher and the content in brewer´s yeast was 3 times higher compared to the contents mentioned in literature references. In the yeast samples the presence of thiamine triphosphate was detected. In brewer´s yeast flakes a further unknown substance was detected. Up to now it was not possible to identify this substance. In fresh meat the main content of thiamine phosphate esters consisted of thiamine triphosphate and besides that an unknown substance was detected, possibly thiamine tetraphosphate / adenosine thiamine triphosphate. The samples of pork meat were analysed by using an enzymatically modified § 64 LFGB method and the total thiamine content (unphosphorylated thiamine) was determined. These results were compared with the results of the determinations of the single thiamine compounds. The modification of the analytical method by using an enzyme combination results in a higher release of spare thiamine of up to 40 %. All samples were tested for the presence and content of the thiamine compounds as well as the resulting total thiamine content. In freshly slaughtered pork meat a further thiamine compound after the retention of thiamine triphosphate was detected regularly. It is assumed due to the kinetic chemical fate that this compound might be thiamine tertraphosphate or Adenosinthiamintriphosphat (AThTP). The results confirm the suspicion, that thiamine phosphate esters transformation into a non extractable protein-binding form.

In der vorliegenden Arbeit wurden Thiamin- und Thiaminphosphatgehalte in den Getreidearten Weizen (Triticum aestivum, Dekan), Roggen (Secale cereale, Agronom), Triticale (Triticosecale, SW Talentro), Hafer (Avena sativa, Dominik) und Gerste (Hordeum vulgare, Merlot) während der Kornbildungsphase zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten, von der Anbildung der Ähre bis zum Reifezustandes des Getreidekornes, parallel untersucht. Desweiteren wurden Untersuchungen an verschiedenen Hefen der Gattung Saccharomyces cerevisiae, wie frische Bäckerhefe, Trockenbackhefe, frische Bierhefe und Bierhefeflocken durchgeführt. Bei der Bestimmung von Thiamin und Thiaminphosphaten in frischem Schweinefleisch (30 min post mortem), über einen Lagerungszeitraum von bis zu 9 Tagen (216 h), fand parallel ein modifizierter enzymatischer Aufschluss derselben Schweinefleischprobe über einen Zeitraum von 72 Stunden statt, die im Vergleich zur LFGB § 64 Methode verbesserte Ergebnisse liefert. Für die simultane Bestimmung von Thiamin und der Thiaminphosphate wurden eine neu entwickelte kombinierte Festphasenextraktion und eine neu entwickelte HPLC-Methode angewendet. Bei der Festphasenextraktion wurde eine C-18 ec-Säule für die Retardierung des unphosphorylierten Thiamins mit einer SAX-Säule zur Retardierung der Thiaminphosphate verbunden. Durch Einsatz dieser neuen Methoden gelang erstmalig eine gleichzeitige Aufreinigung des Thiamins und der Thiaminphosphate sowohl aus der komplexen Getreidematrix als auch aus der komplexen Hefe- und Schweinefleischmatrix. Bei der neu entwickelten HPLC-Methode wurde eine C-8-Säule mit einer NH2-Säule kombiniert. Diese Kombination führt zu einer umgekehrten Retentionsreihenfolge, so dass zuerst Thiochrom retardiert und nachfolgend die höheren Thiochromphosphate ohne, dass interferierende Störpeaks im Chromatogramm vorliegen. Der Einsatz einer Gradientenelution führte zur Verbesserung der Retention, so dass erstmals Thiamin und Thiaminphosphate vollständig voneinander getrennt dargestellt werden konnten. Die Nachweisgrenze lag für Thiamin bei 0,3 ng/mL, für Thiaminmonophosphat bei 0,5 ng/mL und für Thiamindiphosphat bei 0,9 ng/mL. In Triticale, Hafer, Gerste, Weizen und Roggen wurde der Thiamin- und Thiaminphos-phatgehalt in verschiedenen Zeitintervallen während des Reifevorgangs, vom Stadium des Ährenschiebens bis zur Vollreife untersucht. In allen untersuchten Proben konnten Thiamintriphosphat und Thiamintetraphosphat/Adenosin-thiamintriphosphat nicht nachgewiesen werden. Es wurden nur Thiamin, Thiaminmonophosphat und Thiamindiphosphat unterschiedlicher Konzentration in den Getreideproben bestimmt. Die Analyse der Thiaminphosphate ergab, dass die Anteile der Phosphate am Thiamingesamtgehalt nicht konstant blieben. Der Verlauf und die Verteilung der Thiaminderivate während des Wachstums verhielten sich in allen Getreidearten ähnlich. So lagen zu Beginn der Analyse hauptsächlich Thiamindiphosphat und Thiamin vor, in geringen Mengen auch Thiaminmonophosphat, während der Vollreife fast ausschliesslich nur noch unphosphoryliertes Thiamin vorlag. Der Gesamtthiamingehalt (Summe von Thiamin und Thiaminphosphaten) blieb während des Wachstumsverlaufes, bezogen auf die zunehmende Trockenmasse, mit geringen Schwankungen annähernd gleich. Nur bei Triticale fand eine Verminderung des Thiamingehaltes zum Reifezeitpunkt hin statt. Bei allen Getreideproben ist zu Beginn der Untersuchung immer ein gewisser Anteil an Thiamindiphosphat vorhanden, der sich im Laufe der Kornreife verringert. Dieser Anteil beläuft sich zwischen 16,5 % bei Triticale und bis zu 46,9 % bei Hafer. Thiaminmonophosphat ist mit einem Anteil von 1,2 % bei Gerste bis zu 13,6 % in Hafer zu Beginn der Messung vorhanden. Zum Ende der Untersuchung liegt in allen Getreidearten fast ausschließlich freies Thiamin mit einem Anteil von durchschnittlich 97 % vor. Ein geringer Anteil an Thiamindiphosphat ist zum Teil noch vorhanden. Thiaminmonophosphat konnte beim Zustand der Vollreife nicht mehr nachgewiesen werden. Eine Besonderheit zeigte sich allerdings bei Roggen und Weizen während des Wachstumsverlaufes bzw. während des Reifevorganges. Eine erneute Synthese von Thiaminmonophosphat fand bei Weizen bei einem Trockensubstanzgehalt von 56,79 % und beim Roggen bei einem Trockensubstanzgehalt von 87,85 % statt. Normalerweise geht das reife Korn in das Keimruhestadium über und mobilisiert die Reserven beim erneuten Keimvorgang. Zu diesem Untersuchungszeitpunkt müssen klimatische Bedingungen vorgelegen haben, die diesen Vorgang beeinflussen und die Getreidepflanze nochmals beginnt Thiaminmonophosphat zu synthetisieren. Welche stoffwechselphysiologische Bedeutung dem Thiaminmonophosphat zukommt ist bis heute noch nicht eindeutig geklärt. Wahrscheinlich ist es, wie im tierischen Organismus, ein Vorläufermolekül für die Synthese von Thiamin oder Thiamindiphosphat, welches wiederum Coenzymfunktion besitzt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass auch diese neue Thiaminanalytik für die Bestimmung der einzelnen Thiaminderivate in verschiedenen Getreidearten zuverlässig angewendet werden kann. Eine Abnahme der Thiamingehalte wie beim Schweinefleisch konnte bei Änderung des Phosphorylierungsgrades in Getreide nicht beobachtet werden. Mit dieser Methode konnte erstmals eine Bilanz der sich im Getreidekorn entwickelnden Thiaminderivate ermittelt werden, die nützliche Ergebnisse des Nährwertes von Thiamin im unreifen Getreide liefert. Bei den Hefen konnten ebenfalls mit der neuen Thiaminanalytik die einzelnen Thiaminderivate gut von der komplizierten Probenmatrix getrennt und in einem kurzen Analysezeitraum bestimmt werden. Der Thiamingehalt in frischer Bäckerhefe lag mit 47 mg/100 g TS Hefe 10 mal höher und der Gehalt in frischer Bierhefe mit 32,7 mg/100 g TS 3 mal höher als die angegebenen Literaturwerte. Bemerkenswert ist der hohe Gehalt an unphosphoryliertem Thiamin in den trockenen Hefen, während die lebenden Hefen vorwiegend Thiamindiphosphat aufweisen. Die frische Backhefe wies bei der Untersuchung auch die Anwesenheit von Thiamintriphosphat und Thiamintetraphosphat/Adenosinthiamintriphosphat in Spuren auf. In Bierhefeflocken zeigte sich sogar eine weitere unbekannte Substanz, die bisher noch nicht identifiziert werden konnte. Da frische Schweinefleischproben vorrangig hohe Gehalte an Thiamintriphoshat und Thiamintetraphosphat/Adenosinthiamintriphosphat aufweisen und den hohen Thiamin-gesamtgehalt bestimmen wurden die Schweinefleischproben mit einer enzymatisch modifizierten LFGB § 64-Methode parallel auf den Thiamingesamtgehalt (unphosphoryliertes Thiamin) untersucht und mit der Bestimmung der einzelnen Thiaminderivatgehalte verglichen. Mit den zeitlich abhängigen Transformationsvorgängen des Schweinefleisches war innerhalb von 24 Stunden ein Verlust an Thiamin zu verzeichnen, der jedoch bereits nach 48 Stunden derselben Probe wieder ansteigt. Zu diesem Zeitpunkt liegt hauptsächlich Thiamindiphosphat vor. Nach einem Zeitraum von 216 Stunden liegt fast ausschliesslich  freies Thiamin vor. Dieser scheinbare Verlust wurde durch Einsatz einer modifizierten Methode untersucht. Diese Modifikation der Methode durch Einsatz einer Enzymkombination führte zu einer höheren Freisetzung, von bis zu 40 % mehr, an freiem Thiamin. Alle Proben wurden auf das Vorhandensein der Thiaminderivate und auf dessen Gehalt und den daraus resultierenden Thiamingesamtgehalt untersucht. Das Ergebnis bestätigt den Verdacht, dass Thiaminphosphate während der Transformationsvorgänge während der Fleischreifung vorrübergehend in eine andere Bindungsform übergehen, die durch die Extraktion nicht zugänglich gemacht werden können. Dabei könnte es sich um Protein handeln, da der modifizierte enzymatische Aufschluss Thiamin aus Proteinbindung freisetzt und mehr Thiamin zur Analyse zugänglich gemacht wird. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die neu entwickelte Methode zur Thiaminanalyse für die verschiedenen Materialien sehr effizient ist und bei komplexer Probenmatrix zuverlässig angewendet werden kann.

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Buchholz, Martina: Bildung von Thiamin und seinen Thiaminphosphorsäureestern in Getreide während des Pflanzenwachstums, in diversen Hefen und der Abbau während der Fleischreifung. Hannover 2012. Tierärztliche Hochschule.

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